血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-I型诊断中的应用（中华儿...

酪氨酸血症I型(tyrosinemla type I)是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶富马酰乙酰乙酸水解酶缺（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代障碍所致的一种遗传代谢病（酪氨酸代谢途径见图1），又称肝肾型酪氨酸血症，属于常染色体隐性遗传，本病发病率约为1/2 000至1/100 000[1]。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于1岁以后，以生长发育迟缓、进行性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现。近几年随着串联质谱和气相色谱-质谱的应用，有关酪氨酸血症I型报道越来越多，但由于引起肝病的其他代谢病如Citrin蛋白缺乏症、半乳糖血症等，也可引起血酪氨酸增高及尿中酪氨酸代谢产物增高，故两者较难鉴别，常引起误诊。酪氨酸血症I型患者血和尿琥珀酰丙酮增高[1,2]，后2种疾病血和尿琥珀酰丙酮正常。通过总结我科于2003～2010诊断的11例酪氨酸血症I型患者临床及实验室资料，探讨血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-I型诊断中的价值。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

对象与方法

一、对象

临床表现为肝肿大，血酪氨酸增高的190例患儿。其中男103例，女87例；年龄均值8个月（3天-14岁）。

二、方法

1.常规实验室检测：血、尿常规检查、肝肾功能、血气分析、血糖、血氨、血乳酸、血钙磷镁、肝脏B超及肝脏核磁共振等。

2.血氨基酸、酰基肉碱检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，具体方法见参考文献[3]。

3.血琥珀酰丙酮检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，参考文献[4]，取直径为3 mm的疑似酪氨酸血症患者的干血滤纸片于96孔过滤板内，每孔加入100 µl 80%乙腈（含琥珀酰丙酮内标及水合肼），65 ℃孵育30 min，过滤至另一96孔板，氮气吹干后每孔加入100 µl甲醇，5 min后氮气吹干，每孔加入80%乙腈100µl，取20µl进行串联质谱检测。由美国疾病控制中心提供琥珀酰丙酮质控干血滤纸片作为质控样品。取5个不同浓度 (0、5、10、25及50 µmol/L)的琥珀酰丙酮标准品干血滤纸片进行方法准确性验证，其回收率分别为90%、95%、92%、96%及95%。参考值上下限为1600例健康儿童血琥珀酰丙酮的第99和1百分位。

4.尿有机酸和琥珀酰丙酮检测：尿有机酸和琥珀酰丙酮采用气相色谱-质谱法进行检测，具体方法见参考文献[5]。

5. 酪氨酸血症I型诊断依据：⑴临床表现：肝肿大，伴或不伴有黄疸；⑵血酪氨酸增高；⑶血或尿琥珀酰丙酮增高，见参考文献[1]。

结  果

根据诊断标准，在190例血酪氨酸水平增高患儿中确诊11例酪氨酸血症-I型患儿，其中男9例，女2例，年龄2个月～6岁，小于1岁6例，均无家族史。9例患儿已经死亡，2例存活

一、 患者临床及常规实验室检测结果

患者临床表现及肝功能见表1，所有患儿均伴有肝肿大，7例患儿伴有皮肤黄染。实验室检查显示，所有患儿均出现胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白显著增高，部分患儿谷氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及胆红素增高。肾功能、血糖及钙、磷、镁水平均正常。1 例患儿肝核磁共振显示多发结节，病理活检结果为纤维化结节，非癌变。

表1  11例患者主要临床表现及肝功能

例号

临床表现

肝脏肋下（cm)

甲胎蛋白

碱性磷酸酶

谷氨酸转氨酶

天冬氨酸转氨酶

g－谷氨酰转肽酶

总胆红素

直接胆红素

1

腹胀，肝大1年余

3.0

29.4

956.0

210.0

357.0

642.0

18.5

7.2

2

皮肤黄染3个月

4.0

62.4

792.0

320.0

450.0

253.0

40.2

28.6

3

腹胀半年

4.5

45.4

1043.0

245.0

472.0

526.0

12.3

7.2

4

腹胀，肝大2年余

3.0

25.4

1210.0

142.0

189.0

241.0

16.9

8.3

5

肝脾大10天

3.0

84.4

835.0

25.0

88.0

135.0

37.1

16.1

6

皮肤黄染、腹胀1年余

2.0

35.4

1023.0

231.0

354.0

112.0

21.2

6.4

7

腹泻1周，腹围增大3天

3.5

11.2

782.0

12.0

34.0

546.0

14.3

5.2

8

皮肤黄染2个月

5.5

35.4

1024.0

41.0

12.0

137.0

32.7

22.2

9

肝大、腹胀1个月

5.0

89.4

963.0

136.0

215.0

312.0

29.6

18.9

10

腹泻1周，腹围增大3天

4.5

126.0

1250.0

33.0

153.0

286.0

47.4

23.8

11

皮肤黄染5个月

5.0

56.9

694.0

69.0

466.0

426.0

38.5

27.2

中位数

4.0

45.4

963.0

136.0

215.0

286.0

29.6

16.1

注：参考值及单位, 甲胎蛋白:0～0.03mg/L; 碱性磷酸酶:200～350 U/L; 谷氨酸转氨酶:0～75 U/L; 天冬氨酸转氨酶:10～42 U/L; g－谷氨酰转肽酶:16～73 U/L; 总胆红素:3.5～20 mmol/L; 直接胆红素:0～6.8 mmol/L; 胆汁酸: 0～10 mmol/L

二、 血氨基酸、酰基肉碱、琥珀酰丙酮及尿有机酸检测结果 

见表2。所有患者血酪氨酸水平增高，苯丙氨酸水平正常，血琥珀酰丙酮水平均增高，但在7例做过尿气相色谱-质谱检测的患儿中仅4例尿琥珀酰丙酮增高，3例未检测出。这7例患儿尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸均显著高于参考上限值。

表2  酪氨酸血症型-I型患者血酪氨酸、苯丙氨酸、琥珀酰丙酮、尿琥珀酰丙酮及有机酸检测结果

例号

血

                     尿（检测值与17烷酸的比值）

酪氨酸

苯丙氨酸

酪氨酸/苯丙氨酸

琥珀酰丙酮

琥珀酰丙酮

4-羟基苯乙酸

4-羟基苯乳酸

4-羟基苯丙酮酸

1

255.4

103.2

2.5

7.8

—

—

—

—

2

419.8

65.3

6.4

7.2

—

—

—

—

3

447.4

86.2

5.2

10.5

—

—

—

—

4

453.5

92.3

4.9

7.3

—

—

—

—

5

234.1

70.2

3.3

10.1

66.2

258.4

1281.4

211.1

6

190.3

63.7

3.0

31.1

0

196.5

607.6

37.1

7

543.3

71.6

7.6

21.3

32.4

194.6

2191.8

482.2

8

324.6

106.2

3.1

17.0

165.6

354.4

1504.8

1275.0

9

201.1

55.5

3.6

13.4

110.1

192.7

2245.9

176.4

10

295.7

56.5

5.2

9.5

0

173.8

881.0

469.9

11

154.7

56.5

2.7

17.4

0

68.1

47.3

35.2

中位数

295.7

70.2

3.6

10.5

32.4

194.6

1281.4

211.1

注：①参考值分别为：酪氨酸：20～100 mmol/L；苯丙氨酸：20～120 mmol/L；酪氨酸/苯丙氨酸：0.5～2.0；血琥珀酰丙酮：0.5～5.0 mmol/L；尿琥珀酰丙酮：0；4-羟基苯乙酸：8～75；4-羟基苯乳酸：0～7.0；4-羟基苯丙酮酸：0～1.0

②“-”表示未检测

讨   论

酪氨酸症I型主要是由于富马酰乙酰乙酸水解酶活性降低或缺失，导致酪氨酸代谢途径的终端代谢发生障碍，富马酰乙酰乙酸增高，其上游代谢物酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸增多，旁路代谢产物4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸；中间代谢产物马来酰乙酰乙酸、富马酰乙酰乙酸增高，导致其旁路代谢产物琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮增高。琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮可与蛋白质的巯基结合，是造成肝、肾损害的主要原因。根据发病年龄，临床将酪氨酸血症I型分为急性型(发病年龄<6个月)、亚急性型(发病年龄6个月～2岁)及慢性型(发病年龄>2岁)[6]。急性型多在新生儿期起病，病情进展迅速，早期症状类似于新生儿肝炎，如呕吐、腹泻、嗜睡、生长迟缓、肝脾肿大、水肿、黄疸、贫血、血小板减少和出血症状等，常在3～9月龄时死于肝功能衰竭。晚发型通常在1岁以后发病，以生长发育迟缓、进行件肝硬化和肾小管功能受损如低磷性佝偻病、糖尿、蛋白尿以及氨基酸尿等，类似Fanconi综合征表现。此病肝肿瘤发生率较高，约30%患儿在3岁内并发肝肿瘤，主要是小细胞肝癌。约40％患儿在病程中会有急性末梢神经受累危象发生，表现为易激惹，疼痛性感觉异常，躯干与颈部过度伸展，同时伴有自主神经异常症状，如血压增高、心动过速和肠麻痹等。大部分未治疗患儿在l0岁以内死亡。故早期诊断及早期治疗是本病预后好差的关键。本组11例均表现为肝损害，1例出现肝内结节，未发现肾脏及心脏损害。4例为急性型，4例为亚急性型，3例为慢性型。9例已经死亡，2例存活，提示此病预后不良。

酪氨酸血症I型由于临床表现不具有特异性，确诊需要依据特殊的实验室检测，包括血氨基酸、琥珀酰丙酮及甲胎蛋白检测,尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸及琥珀酰丙酮检测,富马酰乙酰乙酸水解酶基因或酶活性检测。由于其他疾病引起的肝脏损害如半乳糖血症、Citrin蛋白缺乏症等，也可导致血酪氨酸、甲胎蛋白增高[7]，尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸水平增高，故不能仅凭血酪氨酸或尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸水平增高诊断酪氨酸血症-I型。已有多项研究证实血或尿琥珀酰丙酮增高是诊断酪氨酸血症-I型的重要依据，另外，Matern等[8]通过对21万余例新生儿筛查 6000余例酪氨酸增高的新生儿，检测血琥珀酰丙酮，无1例增高。确诊为酪氨酸血症-I型的56例血琥珀酰丙酮均增高，其中16例（28%）血酪氨酸水平正常[8]。Al-Dirbashi等[9]通过利用琥珀酰丙酮检测进行新生儿酪氨酸血症-I型筛查，发现一部分患儿新生儿早期酪氨酸水平正常，提示通过酪氨酸水平检测进行新生儿筛查，可导致假阳性或假阴性，利用琥珀酰丙酮检测可降低假阳性或假阴性。故已有多个国家将检测血琥珀酰丙酮作为新生儿筛查酪氨酸血症-I型的指标[8-11]。本组11例血琥珀酰丙酮均增高，7例尿气相色谱-质谱检测中只有4例琥珀酰丙酮增高，提示尿气相色谱-质谱气相色谱-质谱检测琥珀酰丙酮可能出现假阴性。Al-Dirbashi等[12]建立利用串联质谱检测尿琥珀酰丙酮的方法，对15例确诊酪为氨酸血症-I型患者尿进行检测，琥珀酰丙酮均显著增高，说明气相色谱-质谱检测尿琥珀酰丙酮可因为检测前处理方法原因导致假阴性。国内已有4篇关于酪氨酸血症-I型的报道[13-16],只有1篇报道是由尿琥珀酰丙酮增高确诊[15]，其他3篇报道是依据血酪氨酸增高、尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸增高，结合临床及其他实验室结果进行诊断。根据酪氨酸的代谢途径，这些病例也可能是酪氨酸血症-II型或III型、Citrin蛋白缺乏症或继发于肝功能损伤等,因为这些疾病也可以导致上述异常，能否确诊为酪氨酸血症-I型值得探讨。故对于临床及其他检测结果提示酪氨酸血症-I型的患者，除通过气相色谱-质谱检测尿有机酸及琥珀酰丙酮外，需要同时检测血琥珀酰丙酮，以便提高酪氨酸血症-I型的确诊率，避免假阴性。

酪氨酸血症I型是一种可治性遗传代谢病，主要治疗方法是控制天然蛋白质摄入、给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗及尼替西农（nitisinone）药物治疗。饮食治疗的目的是减少酪氨酸的摄入及产生，从而降低旁路代谢产物的水平。天然蛋白质摄入量需控制在1～1.5g/Kg.d，不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉用量为1.5～2.0/Kg.d。尼替西农是一种4-羟苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，可抑制酪氨酸转变为4-羟苯丙酮酸，从而使下游代谢产物马来酰乙酰乙酸、富马酰乙酰乙酸及其旁路代谢产物琥珀酰丙酮生成减少，起到治疗作用。此药于1992年开始应用于临床，至今多个国家的应用报道显示，对肝脏、肾脏及心脏功能损害均有显著的效果[17,18]。初始剂量为1mg/Kg.d，分2～３次口服。由于尼替西龙抑制了酪氨酸向4-羟苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过500mmol/L，需要控制天然蛋白质摄入，给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗。否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。