甲基丙二酸血症患者162例血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结...

毋盛楠  韩连书  叶军  邱文娟  张惠文  高晓岚  王瑜  李筱燕  许浩  顾学范

甲基丙二酸血症（methylmalonic academia, MMA）是一种常见的有机酸血症，主要因甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶腺苷钴胺素及甲基钴胺素缺陷，导致患者体内甲基丙二酸、甲基枸橼酸、同型半胱氨酸、3-羟基丙酸及丙酰肉碱等增多，大量有机酸由尿液排出，故可通过串联质谱检测血丙酰肉碱、气相色谱质谱检测尿有机酸进行诊断[1-2]。由于多种因素可导致血丙酰肉碱增高或尿甲基丙二酸水平轻度增高，故对于血串联质谱或尿气相色谱质谱检测结果轻度异常的患者不能轻易诊断此病，需要反复检测或基因检测才能诊断或排除此病[3]。为了帮助临床医生通过分析血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果对此病进行诊断及鉴别诊断，避免漏诊或误诊，现总结2003年12月至2012年3月上海交通大学附属新华医院确诊的162例MMA患者的血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果，探讨MMA患者血丙酰肉碱及尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平的变化特点。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

对象与方法

一、对象

2003年12月至2012年3月来自全国200余家医院的送检标本及患者中经上海交通大学附属新华医院确诊的MMA患者162例，其中单纯型MMA患者51例(单纯型MMA组)，合并同型半胱氨酸血症患者65例(合并型MMA组)，未明确分型46例。男111例，女51例，年龄中位数3个月（1 d～34岁），其中<1个月者38例，1～6个月者58例，6个月～<1岁者19例，1～<3岁者21例，3～<6岁者13例，6～<18岁者6例，≥18岁者7例。对照组为200例健康儿童，男143例，女57例，年龄中位数6个月（4 d~12岁）。本研究经过医院伦理委员会的同意，所有检查均获得患者家属的知情同意。

二、方法

1. 尿气相色谱质谱检测：采用气相色谱质谱技术检测尿液中甲基丙二酸和甲基枸橼酸水平，为半定量方法，其结果为甲基丙二酸或甲基枸橼酸的离子强度与内标17-烷酸离子强度的比值，具体检测方法参考文献[4]。气相色谱质谱仪为日本岛津公司产品（QP2010型）

2. 血串联质谱检测：采用串联质谱技术检测血中游离肉碱（free carnitine, C0）、乙酰肉碱（acetylcarnitine, C2）、丙酰肉碱（propionylcarnitine, C3）和蛋氨酸（methionine, Met）水平，并计算C3与C2的比值（C3/C2）。标本采集用干血滤纸片法，手指采血或静脉抽血，滴于专用采血滤纸上晾干后送检。具体检测方法参考文献报道的方法[5- 6]。串联质谱仪为美国生物应用系统公司产品 (API 2000型/API4000型)

3. 甲基丙二酸血症的诊断及分型: 诊断依据：（1）临床表现，如反复呕吐、嗜睡、惊厥、运动障碍及代谢性酸中毒等；（2）气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平增高；（3）串联质谱检测血C3水平及C3/C2增高；（4）排除维生素B12缺乏等继发因素。部分患者通过基因突变分析确诊。分型依据：MMA患者血清同型半胱氨酸水平增高者为甲基丙二酸合并同型半胱氨酸血症（以下称为合并型MMA），血清同型半胱氨酸水平正常则为单纯型MMA。

三、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。由于患者的检查结果为非正态分布，具体检测结果用中位数（范围）表示；多组间差异比较采用Kruskal-Wallis H检验；两两比较采用Mann-Whitney U检验；相关性分析采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结  果

一、尿气相色谱质谱及血串联质谱检测结果

MMA患者与对照组儿童尿气相色谱质谱及血串联质谱检测结果见表1。MMA患者组尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平及血C3、C3/C2中位数均超出正常参考值上限，且显著高于对照组，差异具有统计学意义（均P<0.01）。162例患者尿甲基丙二酸水平均高于正常参考值上限；145例患者尿甲基枸橼酸水平超出正常参考值范围。mma患者组血c0、c2、met水平中位数虽低于对照组（均P＜0.01，表1），但仍处于参考值范围内。

表1 MMA患者与对照组尿气相色谱质谱及血串联质谱检测结果比较[中位数（范围）]

注：C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；C3：丙酰肉碱；Met：蛋氨酸

   162例MMA患者中15例血C3水平 [3.00(1.50～3.99)mmol/L] 正常，而C3/C2[0.39(0.28～1.27)]高于参考值上限及对照组，差异显著（Z=6.455，P＜0.01）；气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸水平[40.60(6.73～214.39) mmol/L]及甲基枸橼酸水平[2.48(0.00～5.53)mmol/L]显著增高，与对照组相比差异具有统计学意义（分别Z=8.533、5.896，均P＜0.01），经基因检测确诊。其中14例为合并型mma，1例为单纯型mma。

二、血C3水平及C3/C2比值与尿甲基丙二酸水平相关性分析

采用Spearman相关分析结果显示，MMA患者血C3水平分别与尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平呈正相关性（r =0.410、0.236，均P<0.05）；C3/C2与尿甲基丙二酸水平呈正相关性（r =0.336，P<0.05）； C3/C2与尿甲基枸橼酸水平无线性相关关系（r =0.126，P>0.05）。

三、不同类型MMA患者与对照组儿童血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果比较

不同类型MMA患者与对照组儿童血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果比较结果见表2。3组间各检测指标的总体差异具有统计学意义（均P＜0.01）。合并型mma组尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平，血c2、c3及met水平均低于单纯型mma组，差异具有统计学意义（分别Z=5.27、4.24、2.23、4.08、5.58，均P＜0.05）。单纯型患者血met水平与对照组比较差异无统计学意义(Z= 1.12，P>0.05)；合并型患者血Met水平中位数低于对照组，差异具有统计学意义（分别Z=8.91，P＜0.05）。

表2 不同类型MMA患者与对照组血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果比较[中位数（范围）

注：C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；C3：丙酰肉碱；Met：蛋氨酸；与对照组比较，ap＜0.05；与单纯型患者比较，bp＜0.05

讨  论

MMA是一种常见的有机酸血症，由于甲基丙二酰辅酶A变位酶及其辅酶腺苷钴胺素缺陷，体内缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和奇数碳脂肪酸等分解代谢过程中的甲基丙二酰辅酶A不能转化成琥珀酰辅酶A，旁路代谢增强，导致甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等异常蓄积，造成多脏器损伤，尤其是神经系统损伤。体内蓄积的有机酸与游离肉碱结合，转化为酰基肉碱进行代谢，故患者体内丙酰肉碱增高，尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸增高。MMA根据酶缺陷的类型分为甲基丙二酰辅酶A变位酶缺陷及其辅酶钴胺素(cbl) 缺陷两大类，后者分为cblA、cblB、cblC、cblD、cblF 5个亚型。MMA患者临床表现以反复呕吐、嗜睡、惊厥、运动障碍和肌张力低下等神经系统症状为主，呼吸困难、代谢性酸中毒常见，若不及时诊断治疗，病死率可达80%[7]，幸存者多生长发育迟缓、智力低下。该病患病率美国约为1:48 000，意大利约为1:115 000，德国约为1:169 000 [8]。国内患病率尚不清楚。韩连书等[9]对3070例临床遗传代谢病高危儿童进行血串联质谱检测，检出MMA患者58例，提示国内该病并不少见。

气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸和串联质谱检测血C3是诊断MMA的重要方法，同时可伴有其他酰基肉碱或有机酸的变化[10-11]。气相色谱质谱技术可检测尿中多种有机酸水平，其中尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平增高是诊断MMA较为特异的指标[10,12]。本研究162例MMA患者尿甲基丙二酸水平均高于参考值上限，且显著高于对照组，与血C3水平、C3/C2比值呈正相关，进一步证实尿甲基丙二酸水平增高是诊断MMA较可靠的指标，极少出现假阴性。但由于在其它疾病继发酸中毒时，或慢性疾病引起维生素B12吸收不良等情况下，也可导致尿甲基丙二酸排出轻度增多，而血C3水平及C3/C2比值往往正常[13-14]，可以此排除MMA；故对于尿甲基丙二酸水平轻度增高患者，需结合血串联质谱检测结果综合分析，部分还需要基因检测进行诊断，以免造成假阳性，误诊此病。

串联质谱检测血C3和C3/C2比值增高对诊断该病有重要意义，本研究162例患者中15例患者血C3水平处于正常参考值范围内，而C3/C2比值增高，以此提示此病可能，结合气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸水平增高，并经基因检测诊断为MMA；可能由于急性期MMA患儿进食少或有呕吐，肉碱摄入不足，此病又消耗大量肉碱，导致体内游离肉碱水平降低，结合的肉碱即酰基肉碱（如C2、C3）相应降低，此时血C3可在正常范围，但与其他酰基肉碱的比值（如C3/C2）仍增高。除此之外，其它疾病引起酸中毒时可导致继发性血C3轻度增高而C3/C2比值往往正常。上述情况下，若仅依据血C3水平则可造成假阴性或假阳性，导致漏诊、误诊[15]。为降低仅依据血C3水平诊断MMA所造成的假阴性及假阳性率，la Marca等[16]和Shigematsu等[3]分别建立了利用串联质谱和气相色谱质谱技术检测干血滤纸片中甲基丙二酸的方法作为二级检测指标，可提高MMA诊断特异性，但这些方法对实验条件、技术和费用的要求较高，尚未得到推广。目前主要通过对血C3及其与其它酰基肉碱水平的比值进行综合分析以更好的辅助诊断[17-18]。Lindner等[19]对20万例新生儿筛查血串联质谱检测酰基肉碱谱的结果进行分析发现，仅依据血C3水平增高诊断MMA，特异性约为98.465 %，仅利用C3/C2比值增高即可将诊断特异性提高到99.764%，而综合分析血C3水平和C3/C2比值可使诊断特异性提高到99.903%。上述结果均进一步提示利用串联质谱技术诊断MMA时，C3/C2比值可能比血C3水平更为可靠，可降低假阳性及假阴性率。另外，其它疾病如丙酸血症时血C3水平和C3/C2比值亦可同时增高，仅以此尚不能诊断MMA，此时必需结合气相色谱质谱检测尿有机酸，丙酸血症患者尿甲基枸橼酸、3-羟基丙酸及丙酰甘氨酸增高，MMA患者尿气相色谱质谱甲基丙二酸增高，以此可对两者进行鉴别。

如上所述，由于气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸和串联质谱检测血C3都可能出现假阴性或假阳性结果，临床工作中不能仅依据气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸水平增高或串联质谱检测血C3水平增高诊断MMA，需将两种方法密切结合，一般血C3、C3/C2和尿甲基丙二酸同时增高才能诊断[15,17]。对于有反复呕吐、嗜睡、代谢性酸中毒等临床表现而上述检测指标轻度异常者，则需多次送检，必要时行基因检测进行诊断。另一方面，有部分患者病情危重，可于发病数天内死亡，若仅采尿进行气相色谱质谱检测或仅采血进行串联质谱检测，待结果出来，需要进行血串联质谱检测或尿气相色谱质谱检测进行鉴别时，可能会因患儿死亡不能再次采血或尿进行验证是否为此病，进一步提醒临床医生对于疑似有机酸血症的患者需要同时送检尿气相色谱质谱及血串联质谱，以便尽快做出诊断及鉴别诊断。

MMA中的cblC、cblD、cblF 3型同时导致钴胺素缺陷，而甲基钴胺素是同型半胱氨酸合成蛋氨酸的辅酶，故该3型同时导致蛋氨酸合成障碍，患者血甲基丙二酸及同型半胱氨酸均增高，蛋氨酸降低，表现为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症。而甲基丙二酰辅酶A变位酶缺陷型及cblA、cblB型由于不影响甲基钴胺素活性，蛋氨酸合成正常[13,20]。本研究资料分析结果单纯型MMA组血Met水平中位数正常，合并型MMA组血Met水平中位数低于参考值下限，且低于单纯型MMA组和对照组，符合其发病机制。值得注意的是，维生素B12缺乏症时患者亦可出现血清同型半胱氨酸及甲基丙二酸浓度增高，需与合并型MMA鉴别[21]。

综上所述，气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平显著增高对诊断MMA具有特异性，但尿甲基丙二酸轻度增高者不能诊断此病；串联质谱检测血C3水平和C3/C2比值增高，对诊断MMA有重要提示价值，其中C3/C2比值增高更为可靠，但亦存在假阳性及假阴性可能。故诊断MMA需将两种检测方法相互结合，以便减少漏诊及误诊。血C3水平、C3/C2比值及尿甲基丙二酸水平轻度增高的患者可能为继发性改变，需要反复检测或基因检测才能确诊。

志谢：参与试验患者及其家长的配合；全国送检样品的医生的支持。