婴儿期起病的糖原贮积症2型一家系的临床分析与产前基因诊断...

婴儿期起病的糖原贮积症2型一家系的临床分析与产前基因诊断

刘 舒广东省妇幼保健院儿童遗传代谢内分泌科刘舒

发表于《中国优生与遗传》杂志2015年第10期

【摘要】 目的 对中国大陆地区婴儿期起病的早发型糖原贮积症Ⅱ型患者进行临床分析、基因突变分析及产前基因诊断。方法 对2例婴儿期起病的糖原贮积症Ⅱ型患儿进行临床分析，并提取患儿及其父母的外周血 DNA，应用聚合酶链反应(PCR)扩增α-1,4-葡萄糖苷酶基因(GAA)的19个外显子，直接测序，进行先证者及其父母的基因突变检测；在明确先证者基因突变后，对胎儿进行产前基因诊断。结果 家系中2例患儿的发病时间均较早（第一胎男孩为1月+，第二胎女孩为2月），临床主要表现为心脏和骨骼肌受损的征象，以心肌和呼吸肌受累最为明显，患儿表现为明显的四肢肌张力低下，呼吸急促，口唇发绀，辅助检查提示患儿肌酸肌酶升高，胸部正位X片示心影增大，以心室为主，心脏超声示心脏明显增大，心肌肥厚。突变检测: GAA基因测序发现该家系先证者存在2个突变，分别为错义突变c.1935C>A（D645E）和无义突变c.1822C>T（R608*），其中后者为新突变，50例健康人对照100个等位基因测序未发现该位点的突变；羊水细胞GAA基因检测未发现该家系上述2个位点突变。结论 婴儿期起病的糖原贮积症Ⅱ型患儿临床表现均较为严重，死亡率高，主要死亡原因为呼吸肌和心肌受累所导致的呼吸、心脏功能衰竭。本研究对一个糖原贮积症Ⅱ型家系进行了临床分析和基因诊断，明确了先证者发病的遗传学病因，并发现了一个新突变，为这个家庭的产前诊断和最终健康孩子的出生，打下了坚实的基础｡

【关键词】糖原贮积症, α-1,4-葡萄糖苷酶基因，产前诊断

Clinical and prenatal genetic diagnosis in a family of the infantile-onset Pompe disease inChina

【Abstract】Objective To carry out clinical, genetic and prenatal diagnosis for a family of the infantile-onset glycogen storage disease type II(GSD II, Pompe disease)．Methods Two cases of infantile-onset glycogen storage disease type Ⅱ (GSDⅡ) children with clinical analysis, extraction of peripheral blood of children and their parents DNA, polymerase chain reaction (PCR) amplification of α-1, 4- glucosidase gene (GAA) of 19 exons, direct sequencing, were the parents of the proband and gene mutation; in clear proband mutation after prenatal diagnosis of the fetus. Result Two children in the family showed early onset of the clinical manifestations (the first was a boy in the first month, the second was a girl in the second month), the main clinical manifestations of heart and skeletal muscle damage signs to cardiac and respiratory muscles The most obvious involvement, patients showed significant limb hypotonia, shortness of breath, cyanosis of lips, auxiliary examinations showed elevated creatine kinase, chest X ray and echocardiography shows significantly heart enlargement and cardiac hypertrophy. Mutation study revealed two mutations in this family, which were missense mutation c.1935C> A (D645E) and nonsense mutation c.1822C> T (R608 *), and the latter was a new mutation , which was not found in 50 cases of healthy controls. The two mutations were not found in the amniotic fluid cells. Conclusion The clinical manifestations of infantile-onset GSDⅡ were severe in children with high mortality, the major cause of death were respiratory and cardiac failure. In this study, we carried out clinical and genetic diagnosis in a glycogen storage disease type Ⅱ pedigree, and found a new mutation, which lay a solid foundation for prenatal diagnosis of this family.

【Key words】 Glycogen storage disease type II, GAA, prenatal diagnosis

糖原贮积症Ⅱ型(glycogen storage disease typeⅡ, GSDⅡ)，又称Pompe病，是溶酶体内酸性α-1,4-葡萄糖苷酶(acid-alpha-glucosidase, GAA)基因缺陷引起的常染色体隐性遗传疾病，根据已有文献报道，该病在北美和欧洲发病率约为1/40000[1]，在中国台湾发病率约为1/50000[2]。GSDⅡ的发病机制是：GAA缺陷，导致糖原不能被分解，堆积在溶酶体和胞质中，造成溶酶体的增生和破坏，相应的脏器结构和功能损害，受损的脏器多累及心肌、骨骼肌和平滑肌。GSDⅡ分为婴儿型/经典型和迟发型，婴儿型患儿，在生后数月即出现有心肌、骨骼肌受累的征象，如心脏增大、心肌肥厚、严重肌无力、呼吸衰竭等，该型患儿疾病进展快，多于1～2岁之内死于心肺功能衰竭；迟发型常于幼年期或成人期起病，以骨骼肌受累为主，表现为进行性肌无力和呼吸困难，进展缓慢，常死于呼吸功能衰竭[3]。目前在西方发达国家已采用重组GAA酶替代疗法对GSDⅡ进行治疗，临床研究结果显示，GAA酶替代疗法能显著延长患儿生存时间和改善生活质量，但治疗费用非常昂贵[3]，故迄今中国大陆尚无酶替代治疗的报道。因此，开展产前诊断对于患者父母生育正常儿有着重要的现实意义。本研究中我们对2例婴儿期起病的GSDⅡ早发型患儿进行临床分析和基因突变的检测，明确了疾病的诊断，并通过胎儿羊水GAA基因分析的方法，进行了产前诊断。

对象和方法一、研究对象2005年1—12月收入儿科病房的2例幼年起病的Pompe患儿：例1：男，2岁9个月，因走路慢，容易跌倒1年人院；例2：女，9岁，发现肝酶，肌酶升高7年人院。经测定皮肤成纤维细胞内酶活性确诊。均取得患儿及其监护人的知情同意。二、方法1．临床分析：临床病史，实验室生化检查，影像学，心电图、神经电生理，肌肉病理(股四头肌活检)检查等，对例2患儿进行了随访。

对象与方法

一、研究对象

有先天性心脏病、心肌肥厚家族史的一家庭来自我院就诊。患儿女，3个月，系第2胎。因“明显咳喘、纳差，胸部X光片发现心脏增大”就诊。患儿生后2个月出现喂养困难、睡眠差、哭声弱、多汗，及四肢肌张力低下，随访治疗3个月后，患儿死于心功能不全。先证者有一哥哥，出生后3个月出现类似症状，1年前因呼吸、心脏衰竭死亡。现母亲再次怀孕，要求进行遗传咨询和产前诊断。签署知情同意书后行家系分析和产前诊断。

二、研究方法

1．临床分析：临床病史、实验室生化检查、磁共振、心脏彩超、心电图等，对患儿进行了随访。

2. 分子遗传学检测

2.1 基因组DNA 提取：因患儿已死亡，故EDTA二钾抗凝管采集患儿父母的静脉血2 mL，同时抽取患儿母亲羊水10ml。标本基因组DNA 抽提使用Qiagen试剂盒，按照操作规程进行。所有检测均签署知情同意书。

2.2 GAA基因序列获取：从UCSC数据库获取人类GAA基因DNA序列。

2.3 PCR反应

2.3.1 PCR引物设计：利用primer premier 5.0设计能够扩增GAA基因编码区､非翻译区及外显子-内含子交界处剪切位点的引物，由广州华大生物公司合成。

2.3.2 PCR反应体系：PCR 反应体系为25μL，体系组成为~30ng/μL浓度基因组DNA 1μL，TAKARA公司rTaq酶反应混合体系(Taq酶，dNTP，MgCl2)12.5μL，浓度为10μM的正向和反向引物各1.0μL，双蒸水9.5μL。

2.3.3 PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 S；58℃退火30s；72℃延伸40s，共38个循环，终端72℃延伸5 min｡

2.4 测序及结果分析：PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序｡测序结果采用SequenceScanner 1.0软件(Applied Biosystems)进行分析，所得序列与UCSC数据库中的GAA基因序列进行比对｡ 碱基变异命名参照den Dunnen以及Antonarakis 命名法则｡

3 生物信息学分析

3.1 物种保守性分析：物种保守性分析在mutationtaster数据库进行。

3.2 GAA野生型蛋白结构域获得：GAA野生型蛋白结构域从数据库InterPro：

中获取。

3.3蛋白质结构模拟及功能预测：GAA野生型及突变型蛋白同源模型pdb文件从 CPHmodels 3.2 Server数据库获得：

采用PyMOL软件分析GAA野生型及突变型蛋白的结构改变和可能对功能的影响。

结果

一、临床资料

患儿女，3个月大，系第2胎。因“明显咳喘、纳差，胸部X光片发现心脏增大一个月”入院就诊。经询问病史，患儿生后2个月出现喂养困难（喂奶每次只能吃约50ml）、睡眠差、哭声弱、及四肢肌张力低下。入院后查体：营养不良貌，肌张力减退、肌无力，舌体肥大，多汗，特别进食尤甚。

辅助检查：胸部正位X片示心影增大，以心室为主；心脏彩超提示左心室增大，左室收缩功能减退，肥厚型心肌病，中度二尖瓣返流；心电图示左右心室肥厚、心肌缺血。CK 818 U/L（正常参考值：26-140 U/L），CK-MB 157 U/L（正常参考值：0-18 U/L），ALT 92 U/L（正常参考值：5-40 U/L），AST 188 U/L（正常参考值：8-40 U/L）。

患儿入院后给予强心、利尿、抗感染、扩血管等治疗，症状有所改善，治疗5天后出院。患儿出院后，一直门诊随访治疗，3个月后，患儿死于心功能不全。先证者有一哥哥，出生后约1月出现类似症状（口唇发绀，气促，咳嗽，肥厚型心肌病），6月因呼吸、心脏衰竭死亡。患儿父母非近亲婚配，家族中未见类似病史。现母亲再次怀孕，要求进行遗传咨询和产前诊断。

二、GAA基因突变检测

家系GAA基因测序结果发现，先证者同时存在两个不同位点的杂合性突变，即错义突变c.1935C>A和无义突变c.1822C>T。其中位于第14外显子的c.1935C>A突变遗传自父亲，为已知突变，该突变使645位密码子GAC变为GAA，导致天冬氨酸(D)转变为谷氨酸(E)，即p.D645E；而第13外显子的c.1822C>T突变遗传自母亲，为数据库未报道的新发突变，该突变使第608位密码子CGA转变为TGA，导致精氨酸(R)转变为中止密码子，即p.R608*。反向测序也证实此两个突变位点。50名家系外正常人DNA测序未发现相应突变。羊水细胞直接提取基因组DNA和羊水细胞培养后提取的基因组DNA测序结果均显示胎儿未携带其父母已检测到的突变位点，提示胎儿未重复先证者基因型(图1a-f)。经遗传咨询，母亲继续妊娠，并定期随访和产检，今年1月初，胎儿出生，随访至今，未见明显异常。

图1：GAA基因突变位点测序图 1a：患儿c.1822C>T 杂合突变位点；1b：患儿c.1935C>A杂合突变位点；1c：母亲c.1822C>T杂合突变位点；1d：父亲c.1935C>A杂合突变位点；1e：胎儿c.1822位点；1f：胎儿c.1935位点。

三、新突变的生物信息学分析

   对GAA氨基酸在人类、灵长类、大鼠、小鼠、犬属、大象、鸡、热带爪蟾的保守性分析显示，GAA蛋白的第600-616位氨基酸在不同的种属中几乎完全相同，表明该区域在进化中高度保守。突变c.1822C>T位于GAA蛋白C末端的糖苷水解酶超家族亚单位，使GAA蛋白发生提前终止(p.R608*)。经过生物信息学功能预测，GAA蛋白提前终止，极有可能影响该蛋白的生物学功能[图2a-d]。

图2：GAA野生型及突变型蛋白结构图 2a：GAA野生型蛋白结构域示意图，N末端的P型-三叶草结构功能域（IPR000519，第77-141位氨基酸）以绿色表示，半乳糖变旋酶样结构功能域（IPR011013，第104-347位氨基酸）以紫红色表示，C末端的2个糖苷水解酶超家族亚单位结构功能域以蓝色表示（亚基1：IPR017853，第349-522位氨基酸；亚基2：IPR017853，第556-720位氨基酸）。2b：GAA新突变位点c.1822C>T(p.R608*)跨物种间序列比对。2c：GAA野生型蛋白；2d：GAA c.1822C>T(p.R608*)突变型蛋白。

讨论

GSDⅡ又称Pompe病，是由GAA 基因突变导致溶酶体内酸性α-1，4-葡萄糖苷酶活性降低、进而出现以心肌、骨骼肌功能受损为特点的常染色体隐性遗传病。根据发病年龄、病变累及的主要脏器和病情轻重程度，GSDⅡ可分为婴儿型、青少年型和成人型。GSDⅡ的临床表现、病情的严重程度及预后取决于残留的GAA 蛋白的活性[4],婴儿型患者GAA 活性几乎完全丧失（为正常值的0%-1%），生后数月即出现严重的心脏增大、心功能不全、呼吸肌功能减退、四肢无力、巨舌、喂养困难等临床表现，大多数于1 岁内死于肺部感染和心力、呼吸衰竭[5]。青少年型患者仍残留部分GAA 活性（为正常值的2%-6%），大多于10 岁前起病，表现为运动发育迟缓、肌力减退和呼吸肌受累等症状，心脏超声可发现心脏轻度增大，但较少发生心功能不全，死亡原因多见于呼吸衰竭。成年型患者残存的GAA 活性较高（为正常值的7%-29%），多在20 ～60 岁之间发病，临床主要表现为缓慢进展的全身性肌病[6]。

GSDⅡ的发病率在不同的种族间存在明显差异，如荷兰人的发病率约为1/40000[7]，非洲裔美国人的预测发病率则高达1/14000[8]，中国台湾地区人群中的预测发病率约为1/50000[2,9]。目前中国大陆对GSDⅡ的研究较少，尚无相关的流行病学资料，故暂无确切的发病率统计数据。GDSⅡ可结合临床表现、生化检测、病理检查、外周血白细胞溶酶体酸性α-1，4-葡萄糖苷酶活性检测和基因检测等手段进行确诊，其中酶活性测定和GAA基因检测是GSDⅡ确诊的金标准。

GAA 基因位于17q25.2-q25.3，全长约28kb，包含20 个外显子，其中外显子1 为非编码区，不参与蛋白的翻译。迄今为止，共发现400多种突变，分布在该基因的不同区域。GAA 基因突变存在明显的种族特异性，在中国台湾地区人群中，外显子14 的c.1935C>A错义突变是最常见的突变类型，该突变最早于1993年由荷兰科学家Hermans[10]报道，突变使第645 密码子由天门冬氨酸变为谷氨酸，结构和功能研究证实该密码子的改变并不影响酶前体的合成，但影响转录后的修饰和磷酸化过程，从而导致酶活性的丧失，因此，该突变导致的遗传学效应比较严重。本研究的家系也发现了c.1935C>A的杂合突变，患儿该位点遗传自其父亲。此外，本研究还发现在患儿外显子13 上存在c.1822C>T杂合突变，该位点遗传自患儿母亲，使第608位密码子CGA转变为TGA，导致精氨酸(R)转变为中止密码子，即p.R608*。经生物信息学预测，该位点可能会影响GAA蛋白的功能。该突变尚未见报道，也不是已知的多态性改变，很可能是一个新的致病性突变位点，但尚需进行功能分析证实。

本研究首次在一GSDⅡ家系中发现GSDⅡ患者同时存在TGM1基因的两个复合性杂合突变c.1935C>A（D645E）和c.1822C>T（R608*），其中后者为新突变，并对该家系进行了临床分析和基因诊断，明确了先证者发病的遗传学病因，为这个家庭的产前诊断和最终健康孩子的出生，打下了坚实的基础｡

参考文献

[1] Martiniuk F, Chen A, Mack A,  et al. Carrier frequency for glycogen storage disease type II in New York and estimates of affected individuals born with the disease. Am J Med Genet. 1998 Aug 27;79(1):69-72.

[2] Chien YH, Chiang SC, Zhang XK, et al. Early detection of Pompe disease by newborn screening is feasible: results from theTaiwanscreening program. Pediatrics. 2008 Jul;122(1):e39-45.

[3] van der Ploeg AT, Reuser AJ. Pompe's disease. Lancet. 2008 Oct 11;372(9646):1342-53.

[4] Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alpha-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002 Mar;2(2):145-66. Review.

[5] van den Hout HM, Hop W, van Diggelen OP, et al. The natural course of infantile Pompe's disease: 20 original cases compared with 133 cases from the literature. Pediatrics. 2003 Aug;112(2):332-40.

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[10] Hermans MM, de Graaff E, Kroos MA, et al. The conservative substitution Asp-645-->Glu in lysosomal alpha-glucosidase affects transport and phosphorylation of the enzyme in an adult patient with glycogen-storage disease type II. Biochem J. 1993 Feb 1;289 ( Pt 3):687-93.