骨形态发生蛋白的细胞内信息传导机制

      骨形态发生蛋白(bone morpho-genetic protein,BMP)，是一种可以在皮下及肌肉等非骨骼系统诱导软骨及骨生成的生长因子,目前已有20几种BMP被分离和克隆, 除了BMP1 (一种前胶原C 蛋白酶, 基因定位于8p 22cen) 外, 其余均属于TGF-B（转化生长因子）超家族[1]。在TGF-β蛋白家族中还有activin,inhibin等因子。对于细胞来讲，这些因子对于细胞的增殖、分化起着调控作用；对于生命个体来讲，这些因子对于个体的发育，创伤的修复以及癌症的发生等过程也起着重要的作用[2、3]。BMP是如何诱导骨生成的？国内、外的研究者从不同角度进行了分析，本文旨对90年代以来BMP的分子信息传导方面的研究做一个简单的概述。徐州市中心医院关节骨科那键
1 BMP配体方面的研究
      BMP是靠二硫化合物结合键来生成BMP二聚体，从而分泌蛋白的。现在已发现了20余种BMP蛋白，根据其特征及构成，将它们分为以下几类（图1）。其中， BMP–1及其相关金属蛋白酶直接参与从动物胚胎到成年期细胞外基质(extracellular matrix , ECM) 中的多种物质调控活动,从而直接或间接地影响着骨骼发生发展以及骨重建的过程和结局。它们作用的实质是通过对各种底物的处理来促进ECM 的形成。ECM的形成是骨骼发生发展和骨重建过程中的重要环节。氨基酸序列83%相同的BMP-2及BMP-4在众多的研究中广为应用。研究者们利用BMP-2 或BMP-4基因的knockout鼠观察到，这些knockout鼠在胚胎期9天即死亡。分析表明BMP-2，4 knockout鼠丧失了中胚层的形成，也就是说，BMP-2及BMP-4在生命体发育的初期起着重要的作用。Luca 等[4]发现, 在骨折愈合过程中,BMP2 通过刺激生长板中软骨细胞增殖、肥大促进长骨愈合，是骨组织工程中研究较热的细胞信号蛋白[5]。最近,在BMP-2诱导成骨及其应用的传送释放系统的研究方面取得了一些新的进展，软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric mat rix protein ,COMP) 是软骨非胶原蛋白的主要成分[6] 。很多组织(如:软骨、滑膜、视网膜、肌腱以及血管平滑肌细胞等) 内都有COMP基因的表达[7] 。COMP 的确切功能尚不清楚,但越来越多的证据表明COMP在细胞外基质的装配过程中起着非常重要的作用[8]BMP-2 能够明显促进COMP 基因在人关节软骨细胞及鼠源性成软骨细胞株ATDC55 内的表达。国内有人证明了BMP一2和BMP-6可以抑制人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的增殖和迁移，并诱导它们凋亡和向成骨细胞分化[9]；BMP-3b和BMP-6在非小细胞肺癌中常因甲基化而失活[10]，人前列腺癌细胞常有BMP受体(BMPRs)的表达缺失，这些都提示BMPs／BMPRs在肿瘤的发生发展中起着重要的抑制性作用；然而，Langenfeld等[11]发现，BMP一2在体外亦可刺激人肺癌细胞株A549和H7249的迁移和侵袭，在体内可以加强A549细胞在裸鼠皮下的生长， Pouliot等也报道BMP S与BMPR II的相互作用促进了人乳腺癌细胞的增殖和存活，说明了BMP一2在肿瘤生长上的双重作用。BMP-4具有多种生理功能, 胚胎期作用类似BMP2,造血系统的作用最引起关注，是胚胎时期造血组织形成所必须的,它能使胚胎干细胞向造血细胞分化,并能促进受损伤的造血组织再生恢复[12] ,骨折愈合时,BMP-4 与 型胶原及肝素相互作用参与血管形成。BMP-7也称为OP-1，为90年代发现的一种成骨能力最强的BMP，与BMP-5，6，8等蛋白构成另外一个亚家族。BMP-7能促进间充质前体细胞向软骨细胞转化, 并促进转化的软骨细胞分泌其特异性的细胞外基质( 型胶原和蛋白多糖) , BMP7亦可诱导骨髓基质干细胞修复各种不同类型的骨缺损[13]， 因而BMP-7 对关节软骨及骨缺损的修复具有重要作用[14]， 另外从BMP-7基因的knockout鼠观察到，它们的肾脏及眼发育不全，并且大多有后肢多肢症。从自然基因突变鼠“short ear”发现了BMP-5的基因突变，这种鼠不仅耳短，而且耳位低，同时有胸骨、肋骨等骨骼发育异常。从软骨中分离出来的基因GDF（growth differentiation factor）-5与GDF-6，7图 1   根据特征及构成BMP蛋白分类形成另外一个亚家族。GDF-5由软骨及关节分泌产生，并促进软骨的生成。从自然基因突变短腿鼠“brachypodism”身上分析到，其病因基因与GDF-5有直接关系。另外，人类的Hunter-Thompson(acromesomelic chondrodysplasia,Hunter-Thompson type:CHTT)和Grebe型骨软骨异常增生症(chondrodysplasia, Grebe type:CGT)的病因基因也与 GDF-5有着密切的关系。
⒉ BMP受体方面的研究

包括BMP在内，从属TGF-β蛋白家族配体的信息是靠一型（BMPRⅠ）及二型的受体（BMPRⅡ）来向细胞内传递的（图2，3）。 

TGF-β蛋白家族配体的信息传导过程                                   
      无论一型受体还是二型受体，都是膜穿透型蛋白，其细胞内领域有丝氨酸·苏氨酸酶的活性。体外成骨试验结果表明TGF-β能诱导BMPRⅠa和BMPRⅡ表达，与BMPRⅡ结合形成复合物再与BMPRⅠa结合,激活BMPRⅠa并将信号传递到下游信号通道[15]。二型受体不依赖与配体的结合，它的激酶具有磷酸化的活性。但是，一型受体在没与配体结合时保持着非活性化状态。一型受体与二型受体可以组成多种同聚体，在这种状态下，配体与二型受体结合后，二型受体会将一型受体细胞膜下部的GS（glycine serine rich）领域磷酸化。GS领域存在于所有的一型受体结构中，为胞内区的近膜部分(N 末端) 有高度保守的丝氨酸甘氨酸(GS) 结构域, 是活化起始的部位[16,17]。GS领域被活化后，一型受体的激酶也被活化。BMP受体的活化，本质上同于TGF-β受体活化。BMP的一型受体与二型受体都可以单独与配体结合，如果两种受体结合，活性将会倍增。作为BMP的二型受体，BMP-Ⅱ，ActR-Ⅱ(activin receptor type Ⅱ)及ActR-ⅡB(type ⅡB)可以与BMP结合。作为BMP的一型受体，BMPR-ⅠA(BMP receptor type ⅠA)，亦称为ALK3，及BMPR-ⅠB(type ⅠB)，亦称为ALK6被广泛地公认。还有研究表明，ActR-Ⅰ(ALK2)也可以与BMP结合。欠失细胞内领域的BMP受体即使与配体结合也不会传导分子信息。鼠C2C12成肌肉细胞在含有血清的培养液中向肌细胞分化，但在BMP时其表现型便向骨细胞方向发展。如果细胞内导入细胞内领域欠失型dnBMPR-ⅠA，向骨细胞的分化即被阻断。
　
3 经由Smad的信息传递
   　最近两年，被称为Smad的一个蛋白家族引起了众多研究者的兴趣，Smad基因最早是Savage 等[18]是通过基因筛查在果蝇体内鉴定出来的。目前从脊椎动物身上至少发现了8种Smad基因。很多研究表明，Smad在传递TGF-β信息过程中起着不可估量的作用。Smad的分子量为45-60KD，与其他蛋白完全不同之处是其N'及C'末端有MH1及MH2领域（图4）。MH1及MH2之间富含脯氨酸中间连结部分。
根据Smad特征及构成，将其分为3类。Smad1，5，8主要负责BMP的信息传导，Smad2，3主要负责TGF-β及Activin的信息传导。经由一型受体被磷酸化的classⅠSmad的C末端有一个磷酸化机关SSXS（丝氨酸-丝氨酸-任意氨基酸-丝氨酸），最近的研究表明被磷酸化的是最后二个丝氨酸。Smad6及Smad7与其它的Smad不同，MH1领域被特异性N末端所代替，它们抑制TGF-β及BMP的信息传导。经由Smad的信息传导的研究进展十分迅猛，以TGF-β及Actin为例简单说明如下：配体与一型受体结合后，经由被活化的受体，Smad2或Smad3被磷酸化，并与Smad4形成复合体，这种异聚复合体从细胞质向细胞核移行。在BMP为配体时，Smad1，Smad5或Smad8经由一型受体被磷酸化，与Smad2，Smad3一样传递着分子信息。可见，Smad的特征为信息由细胞膜向细胞核直接传递。但与Smad1，5，8结合的转写因子还不清楚。Smad6及Smad7对TGF-β，BMP 的信息传递有着调控的功能。Smad6或Smad7可以与一型受体直接结合。自1997年以来，Smad的细胞核内作用也渐渐研究清楚，尤其是对于转写活性化机构方面的研究进展非常迅速。由Actin刺激后，已向核内移行的Smad 2- Smad 4复合体形成了具有winged-helix构造的转写因子FAST及ARF(activin-response factor)，并与Mix2的启动子结合来促进转写过程。TGF-β蛋白家族有着各种各样的功能，它们的信息传导也许还有其它的途径或有cross-talk。最近证明，从属于MAPKK激酶家族的TAK1与TGF-β及BMP的信息传导有关。另外，还有研究证实，生长因子EGF可以将Smad的联结区域磷酸化，从而启动ERK（extracelluar  receptor  kinase）。EGF由MAP激酶中的一员ERK来调控Smad1的机能。ERK经EGF活化后，将Smad1的中间连接部分磷酸化来抑制信息向细胞核内移行。此外，钙离子信息也不容忽视，钙调节蛋白可以与Smad2，3，4直接结合，这种结合依赖于钙的存在，通过钙调节蛋白也可以控制Smad的机能。骨形成等各种复杂的生命现象的调节可望通过TGF-β家族蛋白的信息传导系统及cross-talk系统来寻找明确的答案。

4 经由p38-MAPK的信号传递
Iwasaki等诱导PC12 细胞向神经分化时观察发现p38-MAPK是BMP-2信号的传导途径。在BMP-2诱导C2C12细胞成骨分化时加入p38的抑制剂SB203580后不能表达碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, ALP)；小鼠MC3T32E1 细胞经BMP22诱导分化后,激酶分析和印迹法测定有丝分裂激活蛋白激酶活性(mitogen2activated protein kinases, MAPK) ,结果为p38和JNK被激活, p38能明显增强ALP的活性, JNK则显著增加骨钙素(osteocalcin, OC)的表达;因此认为BMP-2诱导MAPK激活促进细胞分化和成骨, p38-MAPK途径参与了BMP22的成骨信号传导；p38-MAPK途径是非依赖Smad途径的,用荧光免疫法检测胞膜受体的积聚证实预制受体复合物引导Smad途径,与细胞的调控蛋白激酶( ERK) 形成复合物则激活p38-MAPK途径。p38-MAPK途径与Smad途径有协同作用[19]。

5 展望
BMP 独特的生物学效应越来越受到人们的重视。目前研究的热点在于BMP 分子作用的调控机制、BMP分子的特性、BMP 转导途径的调节，相信基于对BMP分子特性认识的进一步深入,BMP作为成骨诱导的信号蛋白,在骨组织工程有重要的作用, 如腺病毒载体(Adv)介导的骨形态发生蛋白2(BMP一2)转基因方法已经应用，并被认为是目前最有效的转基因诱导成骨修复骨缺损的方法之一[20]。在骨组织工程中进一步改造腺病毒载体，降低免疫原性，提高基因治疗的安全性，达到更有效的控释和更合适载体的选择还有待继续探素,建立高效的控释系统应是今后的主要的研究方向。在这些方面的研究正在大量开展, 相信将来会在更多的领域取得进展。

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