宏基因组二代测序（mNGS）
2019年07月29日 16648人阅读 返回文章列表
一、宏基因组二代测序概念
什么是宏基因组二代测序（mNGS）（即metagenomicNextGenerationSequencing），这种检测方法是不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA,利用基因组学的研究策略研究环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。这是一种可广泛分析临床样本微生物组（细菌，真菌，病毒）的高通量测序方法。宏基因组二代测序，通过取样，核酸提取并建库，然后测序，一般一周可以获得分析报告。
第二代测序技术以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记，在大大降低测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。而第一代测序技术-1970s测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，成本高，通量低；使用一种特殊的核苷酸（ddNTP），此种核苷酸可中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。第二代测序技术，在序列读长方面，第二代比第一代测序技术要短很多。
二、高通量测序解决的临床问题：
（一）第二代测序技术解决的临床问题
1.避免漏检——检测范围广：一次性检测覆盖10000 病原微生物
2.检测种类多：细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体、螺旋体、立克次体，可检测到常规手段无法检测的病原体
3.指导精准治疗：检测病原微生物精准到种
4.无需培养，可检测多重感染的情况
5.检测核酸，灵敏度高，灵敏度是PCR的100倍
6.高通量测序，阳性率高
7.不受抗生素、厌氧环境限制
（二）三代测序技术—纳米孔单分子测序技术也即将开展，三代测序技术的特点是
1.单分子测序，无需PCR扩增
2.DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段，不同碱基的加入会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型
3.错误率高（单分子测序通病），通过多次测序来纠正
4.避免PCR偏向性导致的系统错误
三、当前mNGS检测报告和临床解读常用的概念
1.序列数（reads）：指的是匹配到该病原体的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。Reads数越高，表示标本中检测到该病原体的可信度越高。
2.基因组的覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高。
3.深度：是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高。
4.离散度：指检测到某病原微生物的序列在该病原微生物基因组上分布的随机性，随机性越高，检测的可信度越高。
5.微生物丰度：指的是该微生物在整个标本中检测到的相同类型微生物中所占的比重，丰度越高表示其在相同类型微生物中所占的比例越高。
通常情况下，某微生物的检出序列数、深度、离散度和基因组覆盖度越高，表示检测到该微生物的可靠性越高。
四、mNGS结果解读应该注意什么？
1.检出的病原体：检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、试剂工程菌、背景菌还是致病菌。
2.胞内菌/真菌检出率低：胞内感染菌（结核杆菌、军团菌、布鲁菌等）因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体（如真菌），其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
3.RNA病原体的检测：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。
4.可靠程度：不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度，覆盖度，丰度，估测浓度，置信度，各有千秋，需要统一。
最重要的参数：1.病原体；2.序列数
五、mNGS结果如何结合临床进行评判？
1.检出的病原体：报告只能给出病原体，是定植菌、背景菌还是致病菌，需要结合临床。
2.有无临床感染证据：有无发热，感染的症状、体征。
3.实验室检查：结合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6，镜检结果，培养结果，血清学检查。
4.结合影像学改变：影像学改变是感染的重要证据。
5.检测方法：mNGS技术的方法。
不结合临床，NGS报告就是废纸一张
六、mNGS众多的阳性结果（一堆病原体）或者阴性结果如何解读？
（一）要注意影响因素：
1.人体微生态菌群
2.试剂工程菌与背景菌
3.同源序列比对分配算法
经过优化升级，可以给出检测结论，锁定目标病原体，结合临床判断
（二）检测到的众多病原体到底哪个或哪几个是元凶？
1.严格致病病原体：如结核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原体等，可考虑为致病病原
2.条件致病菌：铜绿、鲍曼、肺克、链球菌等，要看测到的序列数，以及排名，结合临床来判断
3.多种病原体混合感染：多病原感染，或呼吸道分泌物、肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因会导致多种病原体检出；这更需要结合临床进行分析
4.常见呼吸道定植菌：一般不考虑致病性，除非序列数特别高
5.罕见、特殊病原体：检索文献，具体分析
（三）mNGS为什么会什么都检测不到（白板）？
有些样本培养、核酸检测阳性，而mNGS却什么都没有检测出来，技术不行？
1.卫生经济成本：经济成本与灵敏度的权衡。当病原体感染后含量很低或用药后病原数量降低，在数据量限定的情况下，靶病原由于信息太少而被丢失
2.检测的局限性：可通过扩大数据量来解决，但在经济成本限定下总有限度
3.人源和背景序列的干扰：人源基因序列巨大的信息量使原本量少的病原难以检测到
4.报告的取舍：公司各自设定的报告序列底线、种类、背景等。
5.改进：通过富集病原菌，加大测序数据量，去除人类基因数量巨大的影响，进而提高灵敏度；检测长片段，进而提高特异性是未来的努力方向
什么是宏基因组二代测序（mNGS）（即metagenomicNextGenerationSequencing），这种检测方法是不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA,利用基因组学的研究策略研究环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。这是一种可广泛分析临床样本微生物组（细菌，真菌，病毒）的高通量测序方法。宏基因组二代测序，通过取样，核酸提取并建库，然后测序，一般一周可以获得分析报告。
第二代测序技术以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记，在大大降低测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。而第一代测序技术-1970s测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，成本高，通量低；使用一种特殊的核苷酸（ddNTP），此种核苷酸可中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。第二代测序技术，在序列读长方面，第二代比第一代测序技术要短很多。
二、高通量测序解决的临床问题：
（一）第二代测序技术解决的临床问题
1.避免漏检——检测范围广：一次性检测覆盖10000 病原微生物
2.检测种类多：细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体、螺旋体、立克次体，可检测到常规手段无法检测的病原体
3.指导精准治疗：检测病原微生物精准到种
4.无需培养，可检测多重感染的情况
5.检测核酸，灵敏度高，灵敏度是PCR的100倍
6.高通量测序，阳性率高
7.不受抗生素、厌氧环境限制
（二）三代测序技术—纳米孔单分子测序技术也即将开展，三代测序技术的特点是
1.单分子测序，无需PCR扩增
2.DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段，不同碱基的加入会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型
3.错误率高（单分子测序通病），通过多次测序来纠正
4.避免PCR偏向性导致的系统错误
三、当前mNGS检测报告和临床解读常用的概念
1.序列数（reads）：指的是匹配到该病原体的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。Reads数越高，表示标本中检测到该病原体的可信度越高。
2.基因组的覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高。
3.深度：是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高。
4.离散度：指检测到某病原微生物的序列在该病原微生物基因组上分布的随机性，随机性越高，检测的可信度越高。
5.微生物丰度：指的是该微生物在整个标本中检测到的相同类型微生物中所占的比重，丰度越高表示其在相同类型微生物中所占的比例越高。
通常情况下，某微生物的检出序列数、深度、离散度和基因组覆盖度越高，表示检测到该微生物的可靠性越高。
四、mNGS结果解读应该注意什么？
1.检出的病原体：检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、试剂工程菌、背景菌还是致病菌。
2.胞内菌/真菌检出率低：胞内感染菌（结核杆菌、军团菌、布鲁菌等）因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体（如真菌），其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
3.RNA病原体的检测：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。
4.可靠程度：不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度，覆盖度，丰度，估测浓度，置信度，各有千秋，需要统一。
最重要的参数：1.病原体；2.序列数
五、mNGS结果如何结合临床进行评判？
1.检出的病原体：报告只能给出病原体，是定植菌、背景菌还是致病菌，需要结合临床。
2.有无临床感染证据：有无发热，感染的症状、体征。
3.实验室检查：结合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6，镜检结果，培养结果，血清学检查。
4.结合影像学改变：影像学改变是感染的重要证据。
5.检测方法：mNGS技术的方法。
不结合临床，NGS报告就是废纸一张
六、mNGS众多的阳性结果（一堆病原体）或者阴性结果如何解读？
（一）要注意影响因素：
1.人体微生态菌群
2.试剂工程菌与背景菌
3.同源序列比对分配算法
经过优化升级，可以给出检测结论，锁定目标病原体，结合临床判断
（二）检测到的众多病原体到底哪个或哪几个是元凶？
1.严格致病病原体：如结核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原体等，可考虑为致病病原
2.条件致病菌：铜绿、鲍曼、肺克、链球菌等，要看测到的序列数，以及排名，结合临床来判断
3.多种病原体混合感染：多病原感染，或呼吸道分泌物、肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因会导致多种病原体检出；这更需要结合临床进行分析
4.常见呼吸道定植菌：一般不考虑致病性，除非序列数特别高
5.罕见、特殊病原体：检索文献，具体分析
（三）mNGS为什么会什么都检测不到（白板）？
有些样本培养、核酸检测阳性，而mNGS却什么都没有检测出来，技术不行？
1.卫生经济成本：经济成本与灵敏度的权衡。当病原体感染后含量很低或用药后病原数量降低，在数据量限定的情况下，靶病原由于信息太少而被丢失
2.检测的局限性：可通过扩大数据量来解决，但在经济成本限定下总有限度
3.人源和背景序列的干扰：人源基因序列巨大的信息量使原本量少的病原难以检测到
4.报告的取舍：公司各自设定的报告序列底线、种类、背景等。
5.改进：通过富集病原菌，加大测序数据量，去除人类基因数量巨大的影响，进而提高灵敏度；检测长片段，进而提高特异性是未来的努力方向
浙公网安备
33010902000463号