阵发性睡眠性血红蛋白尿症研究进展

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种后天获得性溶血性疾病。由于该病患者造血干细胞PIG-A基因突变，引起糖肌醇磷脂(Glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚合成障碍，从而导致经锚而连接在细胞表面的膜蛋白的缺失，导致细胞性能发生变化。血管内溶血、潜在的造血功能衰竭和血栓形成倾向是其三个主要的临床表现。血管内溶血导致游离血红蛋白的释放，可祛除循环中的一氧化氮（NO），从而引起许多症状，包括乏力、勃起障碍、食道痉挛和血栓等。异基因造血干细胞移植可取的根治，最近获美国FDA批准的补体抑制剂eculizumab 可减轻溶血、减少红细胞输注的需求、减少血栓的风险，因此可提高PNH患者的生活质量。北京协和医院血液内科韩冰

 

历史回顾

自19世纪后半叶以来，阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）逐渐引起了欧洲的内科医生的注意，1882年，德国医生Paul Strübing 首先观察到PNH的红细胞在睡眠时血清呈酸性环境下对补体敏感。1939年，哈佛医学院的Thomas Hale Ham首先报道了PNH的红细胞在酸性血清中出现补体介导的溶血的证据，并且使酸溶血实验（即Ham Test）成为诊断本病的特异性实验，直到90年代中期，才由流式细胞仪检测对该病的诊断进行了补充。

伦敦Hammersmith医院的John V. Dacie对PNH的临床和实验室研究也做出了重大的贡献，发现PNH与再生障碍性贫血有密切关系，并由此提出PNH是在骨髓增生低下的背景下发生体细胞突变的结果，而且突变的细胞可能具有不明原因的增殖优势。他的这些论点直到今天依然对PNH的研究有重要的影响。

上个世纪80年代，人们认识到细胞表面存在一种糖肌醇磷脂（GPI）构成的锚，可以将蛋白连接在细胞表面。1989年，人们发现了锚连蛋白中的补体调节蛋白（CD55、CD59等）在PNH的细胞表面缺失，从而对补体敏感。1993年，日本学者Kinoshita T等第一次证实PNH细胞表面GPI锚的缺失是由于发生了PIGA基因突变。

发病机制的研究进展

PNH的异常克隆为何扩增成为优势克隆而导致疾病？PNH患者病态血细胞与正常血细胞同时存在，其各系血细胞皆有膜蛋白缺失。目前认为，PIG-A基因突变和骨髓正常造血细胞增殖机能衰减是PNH发病的两个重要因素，但是如何形成异常造血细胞与正常造血细胞生成和增殖的不均衡状态，异常细胞如何在数量上取得优势的机制依然不清。截至目前，主要有3个假说：A.PNH细胞由于缺乏表面的GPI锚连蛋白，因此逃避了免疫攻击。B.PIGA突变使得细胞获得内在的对凋亡的抵抗，尤其是当骨髓受到免疫攻击的时候。C.PNH克隆发生了第二次突变而产生了内在的生存优势。这些假说并非互相排斥，因为已有数据分别支持这3种假说。

近年的一种观点是PIG-A基因突变在正常人和不少情况下都可发生，但只有当正常造血功能衰竭时，才有可能发展为疾病，这就是PNH发病的双重打击学说。提出正常造血细胞表面具有一些GPI连接旦白，可以成为能刺激细胞杀伤性细胞（如T淋巴细胞）的抗原或共刺激因子，从而被杀伤，而有PIG-A基因突变的细胞由于缺失GPI连接旦白，因而可以逃避捕杀。 Karadimitris等分析T细胞的所有组成成分可以发现异常，自身反应性T细胞的靶向中有GPI连接旦白。王毓洲等[8]的工作也发现： PNH患者外周血中T8细胞/T4细胞比例增高，带有HLA-DR标志的活化的CD8淋巴细胞增多；γ干扰素和IL-2对CD34+CD59+的正常造血干/祖细胞有抑制作用。

人们早就发现，在一些健康人也能检测到PIG-A基因突变。这些在正常人中发生的突变为何没有导致PNH的发生？2006年，Brodsky等研究发现，正常人的PIG-A基因突变是发生在较晚期的造血祖细胞上的，而PNH患者的突变是发生在多能造血干细胞水平。 PNH患者的PIGA突变来源于多能造血干细胞（HSC），PIGA突变的HSC的扩增和分化导致临床疾病。而在大多数正常人，PIGA突变来源于集落形成细胞（CFC），CFC可以分化，但无自我更新能力，因此，这些PIGA突变不导致疾病。这些研究虽然可以部分解释PNH患者异常克隆扩增的原因，但依然无法阐明疾病发生的整个过程，是否在PNH患者中发生了第2个突变，导致患者的PNH克隆获得增殖优势，目前已有许多实验室开始进行这方面的研究。

 

PNH的检测

（一）PNH克隆筛检适应证

1以血红蛋白尿和/或血清游离血红蛋白增高为主要表现的血管内溶血

2无法解释的溶血伴有铁缺乏、腹痛或食道痉挛、血栓栓塞、血小板减少和/或白细胞减少。

3 Coombs试验（-）、未见红细胞裂片、非感染性溶血性贫血。

4 不同寻常的血栓形成：

（1）非常见部位血栓形成：肝静脉（Budd-Chiari综合征）、其它腹腔内静脉（门静脉、脾静脉等）、海绵窦、皮肤静脉。

（2）伴有溶血征象的血栓形成。

（3）伴有全血细胞减少的血栓形成。

5 骨髓衰竭症：

（1）怀疑或确诊的再生障碍性贫血或低增生性贫血

（2）难治性血细胞减少伴一系发育异常

（3）不明原因的血细胞减少症

（二）   需常规随访PNH克隆的患者

确诊PNH患者，应常规监测PNH克隆变化，若病情稳定，可每年监测一次；出现任何临床或血液学参数变化时应缩短监测间隔。

出现溶血和血栓，若可靠的实验室检查未证实PNH克隆存在，则无需密切监测PNH克隆。

（三）检测方法

流式细胞术检测外周血单核细胞和成熟粒细胞CD55和CD59：是目前诊断PNH的金标准由于红细胞受输血影响较大，应对粒细胞、单核细胞进行检测；如果需要评估溶血的程度，应检测红细胞CD55、CD59细胞的比例，尤其是PNH II型细胞的比例，对预测溶血发作有一定提示作用。

流式细胞术检测粒细胞和单核细胞气单胞菌溶素前体变异体（Flaer）： FLAER是Alexa-488标记的无活性气单胞菌溶素前体的变异体，它同野生型前气单胞菌溶素相似，可特异地结合于GPI锚连蛋白，但并不形成细胞通道，不引起细胞溶血，因此不会导致细胞死亡。该标记类似于荧光素，可在一定条件下被激发出荧光，可以通过流式细胞仪进行检测，并区分GPI-和GPI+细胞。FLAER作用于所有GPI蛋白，不会因细胞表达GPI蛋白种类和多少的不同造成误差。因此用荧光标记气单胞菌溶素前体的变异体，是诊断PNH更敏感、特异的方法。同传统的检测CD55、CD59相比，FLAER对检测微小PNH克隆非常敏感，且不受输血和溶血的影响，对一些临床上高度怀疑，而CD55、CD59检测不能确诊的病例，可以结合Flaer检查，获得明确诊断；应用Flaer分析方法诊断并监测PNH患者，可精确分出Ⅱ、Ⅲ型细胞，为判断病情轻重提供依据，有助于PNH患者疾病进展和疗效的判断；对于长期应用免疫抑制治疗的血细胞减少患者，尤其是AA、MDS等疾病，可监测其是否发生克隆性改变以及早发现病情变化。

  用于检测白细胞PNH克隆的抗体组合

                                        Colors

         

Cells

1

2

3

4

5

6

3color

Grans

FLAER

CD24

CD15

 

 

 

3color

Monos

FLAER

CD14

CD33

 

 

 

4color

Grans

FLAER

CD24

CD15

CD45

 

 

4color

Monos

FLAER

CD14

CD33

CD45

 

 

4color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD33

 

 

5color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15/33

CD45

 

5color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD33

 

6color

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD33

CD45

备注：  上表中加深字体的分子标志用于检测GPI锚链蛋白缺乏的细胞，未加深字体的分子标志用于设门。具体荧光选择可以不同，不同试剂荧光颜色也可以不同。4色、5色、6色的检测方式敏感性高，效果良好，如（FLAER/CD24 /CD15/CD45）。 如对单核及粒细胞进行5色分析，则需要准备2个试管。举例：以CD45,CD15，SSC标记通常可区分粒细胞与单核细胞，但若更好的分选单核细胞则需要准备另一根试管进行CD33设门。

 

(四) 国际工作组PNH临床分类

国际PNH工作组（I-PIG）将PNH患者分为如下几类：（1）经典型PNH：该类患者有典型的溶血和血栓形成；（2）合并其它骨髓衰竭性疾病：如再生障碍性贫血（AA）或骨髓增生异常综合征（MDS）；（3）亚临床型PNH：患者有微量PNH克隆，但没有溶血和血栓的实验室和临床证据。（见表）

分类

血管内溶血的速率

骨髓

流式细胞术

经典型

LDH显著增高伴阵发性的血红蛋白尿

骨髓增生活跃伴红系造血旺盛或出现轻微形态异常

GPI-中性粒细胞》50%

合并其它骨髓衰竭性疾病

轻度（常伴溶血的生化指标的微量异常）

同时伴有骨髓衰竭证据（再障或低危MDS）

GPI-中性粒细胞<10%

亚临床型

没有血管内溶血的临床或生化指标的异常

同时伴有骨髓衰竭的证据（再障或低危MDS）

使用高敏感的流式细胞检测手段可见<1%的GPI-中性粒细胞

 

2 PNH患者血栓形成的新进展

虽然血栓栓塞不是PNH的最常见临床表现 ，但它是导致死亡的主要原因，尤其是美国和欧洲的患者。肝静脉血栓、肺栓塞、肠系膜静脉血栓和静脉中风与血栓相关死亡率显著相关。肝静脉血栓导致的Budd-Chiari 综合症是PNH最常见的血栓并发症，是死亡的主要原因。脑静脉和静脉窦血栓是第二位最常见的血栓。在我国，虽没有欧美国家常见，也是导致患者生活质量下降甚至死亡的常见原因。因此，PNH被认为是易栓性疾病之一。

最近的临床研究支持血栓事件的发生与PNH克隆的大小直接相关的假说。 Hall[12] 等人证实10年内发生血栓的风险在中性粒细胞GPI锚连蛋白（GPI-AP）阴性比例>50%的患者是44%， 而中性粒细胞GPI-AP–比例<50%的患者为5.8%。 Moyo[13]等人应用逻辑回归分析模型，计算出每增加10% 比例的GPI-AP–中性粒细胞，血栓的优势比为1.64。 按照该研究，具有>70%的GPI-AP–的中性粒细胞发生血栓的风险比只有20% GPI-AP–中性粒细胞者大11.8倍。

PNH患者血栓前物质和纤溶活性的增加，导致纤维蛋白产生和倍增的增加。除了溶血本身，人们也注意到一些纤溶系统功能丧失，包括PNH表型白细胞的尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂受体的缺失和血浆可溶性尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂受体的增加。在PNH，血小板的刺激伴随着膜磷脂不对称性的缺失，导致丝氨酸磷脂外露和微泡的形成，已在体外试验中被证实。膜来源的微粒体证实可提供凝血前体酶复合物、凝血酶原酶及Tenase复合体（因子Ⅸa、Ⅷa、Ca及磷脂）装配所必需的催化表面。在血流中，高水平的从溶解的红细胞、凋亡细胞或激活的血小板来源的前凝血质微粒体的出现，可解释血栓前状态的播散[14]。

虽然PNH的血栓出血机制还在推测阶段，本病基本的临床表现--慢性的血管内溶血可能是潜在的最重要的原因。严重的血管内溶血事件，表现为乳酸脱氢酶（LDH）的升高和血红蛋白尿，经常与血栓事件以及吞咽困难、腹痛、勃起障碍和严重的乏力相关。这些症状与细胞游离血浆血红蛋白和一氧化氮（NO）清除所致的平滑肌障碍是一致的。在溶血过程中，血浆和尿中的血红蛋白和亚铁血红素的水平增加（血红蛋白血症和血红蛋白尿症），游离血浆血红蛋白清除NO，它与NO有高亲和力，并去除它，而亚铁血红蛋白具有许多促炎症和促氧化特性。此外，溶血也释放红细胞精氨酸酶，---一种转换L-精氨酸的酶，将L-精氨酸（NO合成的底物）变成鸟氨酸；因此，进一步降低了NO。 NO是平滑肌紧张度的调节剂，血小板的激活和血浆NO水平的降低导致平滑肌张力松弛，包括胃肠道的收缩、高血压、勃起障碍和血栓形成。此外，NO还通过下调血小板的聚集和粘附来维持正常的血小板功能。PNH血小板表面缺乏补体调节蛋白CD55 和 CD59，使这些细胞对补体介导的激活敏感，再加上NO的缺乏，导致PNH的血栓倾向。 因此，PNH是血管内溶血伴有所有的NO减少的临床后果的疾病原型，包括血栓出血[15]。

PNH治疗的进展

 

Eculizumab 治疗 PNH

Eculizumab 是人源化的单克隆抗体，与人C5补体蛋白特异性结合，阻止其裂解为C5a 和 C5b，从而不能形成膜攻击复合物。Eculizumab是 IgG kappa免疫球蛋白，其Fc段是 IgG2和IgG4的杂合体，没有下游活性，因此，Eculizumab只是阻断C5的裂解和活化。Eculizumab 一直与靶位点结合，直到从循环中清除。

2002年5月，在英国2所研究所中，开始了Eculizumab的初始临床研究。11例有溶血的输血依赖（入选之前12周有超过4次以上输血）的PNH患者，接受为期3个月的治疗。患者很快改善了生活质量、血尿停止、脱离了输血依赖。2006年，多中心，双盲、随机、安慰剂对照的TRIUMPH试验显示了对经典型PNH的疗效：该试验入组严格， 87例随机分为安慰剂组 (N = 44) 或 eculizumab (N = 43)， 600 mg/w 4周，随后900 mg 1周， 然后每2周900 mg 共6个月。治疗组血红蛋白稳定，输血次数为0，生活质量提高，LDH下降。主要副作用：头痛、鼻咽炎、背痛和上呼吸道感染（治疗前接受脑膜炎疫苗）。2006年，更广泛的、开放适应症的、非安慰剂对照的III期SHEPHERD试验： eculizumab剂量同前，应用52周，贫血减轻、输血减少、生活质量提高、副作用同前，进一步验证了其安全性和有效性。总共195 例参加上述3个试验的患者，其中187例完成了上述试验并参加了为期2年的3b期开放标签的扩展研究（2007）：感染发生率并未增加。 先驱研究及其引出的随后的2个研究： TRIUMPH 和 SHEPHERD研究，最终使Eculizumab在2007年获得了美国FDA和欧洲药物协会（EMEA)的批准[19-21]。

Eculizumab除了很好地控制了PNH的溶血外，对PNH 的其他并发症也有一定作用：血栓：上述3个临床试验中也观察了血栓并发症的情况， 对治疗前后血栓发生的数目和部位都进行了详细的记录。在总共195个患者中，Eculizumab治疗前共有血栓事件124例次，平均7.37次/100患者/年，而治疗后仅1.07/100患者/年，因此Eculizumab治疗显著地降低了血栓的发生率(P < .0001)。进一步的研究显示，即使在有抗凝治疗（肝素、华法令）情况下，PNH血栓的发生率依然很高，而加上Eculizumab后，血栓事件几乎没有。因此，在常规抗凝治疗不能防止进一步血栓形成时，Eculizumab可以很好地控制血栓的发生。肾功能衰竭：从Eculizumab研究的早期数据看，补体抑制可减轻肾功能的破坏，因此可以改善肾功能。 一氧化氮的消耗：PNH的许多症状，可能都与血浆中游离血红蛋白消耗一氧化氮（NO）有关。除了与NO消耗相关的症状，血管内溶血的后果还包括肺动脉高压。Eculizumab可以抑制地减轻血管内溶血，可以大大改善NO消耗相关的症状[19-21]。

但是，Eculizumab必须保持在35 µg/mL 以上以维持对 补体的阻断。少部分PNH患者的药物谷浓度低于35 µg/mL，而且血管内溶血可再次发生。对大多数患者来说这种对补体抑制的突破可以通过稍微提高Eculizumab的剂量到900mg/12天或1200mg/2周来避免； 此外，PNH细胞表面同样缺乏另一种补体调节分子衰变加速因子（DAF或CD55），它可防止C3裂解和C3b产生。Eculizumab的阻断作用是在C3以后水平的，C3在用药后产生会增加，因为DAF的缺乏，可导致细胞表面C3b的堆积。由于PNH红细胞上富有C3b和C3d，因此更迅速地被网状内皮系统清除，而引起血管外溶血。尽管Eculizumab可以解决血管内溶血，但血红蛋白并未恢复到正常水平；大多数PNH患者接受Eculizumab治疗会停止输血，这样会导致PNH红细胞的比例增加，一旦停止Eculizumab，可能会出现血红蛋白的突然下降Eculizumab和严重的血红蛋白尿。 因此，如果不得不停止使用Eculizumab，应密切观察病人，一旦出现症状，考虑输注红细胞。不用说，应教育病人不应简单停止哪怕一次约定的治疗；补体活化瀑布可以在C5水平终止而去除了末端补体活性，引起的副作用最主要的问题是荚膜菌的感染，尤其是奈瑟氏菌感染（脑膜炎球菌或淋球菌）。少部分患者，虽曾经接受脑膜炎疫苗接种，还是发生了脑膜炎球菌的感染（到目前为止都是败血症而非脑膜炎），发生率为0.5例/100接受治疗患者。降低脑膜炎球菌感染的2个措施包括接种疫苗和早期治疗[19-21]。

综上所述，目前应用Eculizumab的指征为：具有中度或重度PNH症状（如显著的乏力和生活质量很差）；已经发生或正在发生PNH的合并症，如血栓或肾功能不全的患者。AA/PNH 可能反应不佳，因为骨髓抑制，而非补体介导的溶血是贫血的主要原因。此外，该药价格昂贵，目前尚未进入我国。

由于C5单抗的使用， PNH患者的生存率数据已经和正常人群比较无显著差异。去年英国研究者对BMT指征的PNH患者比较了BMT和C5单抗两种治疗方法的生存率，结果发现，在合并AA的患者中，C5单抗治疗效果优于BMT，在有合并血栓的患者中，两者也基本一致。因此目前国外并不推崇PNH患者进行骨髓移植，用C5单抗就能获得较好的生存和生活质量。C5单抗在妊娠患者中应广泛应用，有11例患者安全怀孕和生产。对需要治疗的患者，C5单抗的治疗从PNH患者开始怀孕到产后3个月内都要使用。