聚精颗粒对弱精子症 CDY基因表达变化的作用研究

聚精颗粒对精子核蛋白组型转换异常弱精子症的CDY基因表达变化

卞廷松1，谈小林1，史兵伟1，杨光1，金文涛1，徐福松2

（1.南京中医药大学附属常州市中医院 , 江苏 常州 213003; 2江苏省中医院, 江苏 南京 210029.）

摘要: 　目的: 评价聚精颗粒治疗核蛋白组型转换异常弱精子症的有效性和安全性，并分析治疗前后CDY基因表达变化。　方法: 选择核蛋白组型异常弱精子症患者63例 ,给予聚精颗粒治疗 3个月 ,治疗前后分别采用核蛋白组型转换半定量、CDY基因定量表达和DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统进行检测分析，观察治疗前后精液常规参数以及核蛋白组型转换、CDY基因定量表达的变化。并以56例正常生育者作为对照。　结果: 与正常对照组比较，精子密度有差异性(ｐ<0.05)，而精子核蛋白组型转换半定量值、a级精子、（ａ＋ｂ级）精子和活率均有显著的统计学意义（ｐ<0.01）。在聚精颗粒治疗3个月后，精子密度有差异性（P<0.05），而治疗后精子核蛋白组型半定量值和a级精子、（ａ＋ｂ级）精子、活率等主要精液参数指标，均有显著改善（ｐ<0.01）。结论: 聚精颗粒不但能够改善主要精液参数指标，而且能够促进精子核蛋白组型转换半定量值下降，通过促进CDY基因的表达增加，从而达到调节精子核蛋白组型转换的作用。

关键词: 弱精子症;精液参数; 精子核蛋白组型转换; CDY基因

changes of Jujing granulation on ashenopermia with abnormal spermatozoa nucleoprotein transition and CDY gene expression       

Bian Tingsong1，Tan Xiaolin1，Tan Xiaolin1， Shi Bing-wei1，Yang Guang1，Jin Wentao1, Xu Fusong2

1.Department of Andrology，Changzhou hospital Affiliated to Nanjing University of TCM，Changzhou, 213003; 2. Nanjing Vocational College Jiankang, Nanjing, Jiangsu, 210029.3. Department of Andrology，Province hospital of Nanjing University of TCM, Nanjing, Jiangsu, 210029.

Abstract:　Objective: To explore the effeciveness and security of Jujing granulation on ashenopermia with abnormal spermatozoa nucleoprotein transition,and analyse the variaion of CDY gene expression before and after the treament。Methods:63 patients of ashenopermia with abnormal spermatozoa nucleoprotein transition were selected at our clinic of andrology,and they were given Jujing granulation for 3 months.The spermatozoa nucleoprotein transition、CDY gene expression and computer assisted sperm analysis system were detected before and after the treatment. Compared with 56 men on normal Fertility.Results: Compared with normal control group, there was change in sperm concentration（P<0.05），but there were significant changes in spermatozoa nucleoprotein transition、rapid motility、forward motility and percent necrospermia（P<0.01. sperm concentration was changed after 3-month Jujing granulation therapy（P<0.05）,and spermatozoa nucleoprotein transition、rapid motility、forward motility and percent necrospermia were changed significantly after the treatment（P<0.01）. Conclusion: Jujing granulation can improve the major sperm paremeters,it can dercease spermatozoa nucleoprotein transition also by means of increasing CDY gene expression,We can achieve the object of accommdating spermatozoa nucleoprotein transition.      

Key words: Ashenopermia; Sperm paremeters; Spermatozoa nucleoprotein transition; CDY gene

 不孕不育严重地影响了夫妇之间的感情和家庭生活质量。不孕不育病因中因男方因素的

约占４０％左右。由于男性不育症的病因目前尚未完全阐明，本研究观察弱精子症患者的核蛋白组型转换、CDY基因的变化，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1试验方法 采用单中心、正常和自身前后对照、开放性临床观察研究。

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基金项目：江苏省常州市卫生局青年人才项目课题。（项目编号：cs2010217）

通讯作者 :卞廷松 

     1.2试验程序 临床检测筛选入选病例，治疗前和治疗3个月后随访复查，评价药物的有和安全性。

1.3.1 病例选择：69例患者均为 2005年 9月～2010年12月在南京中医药大学附属常州市中医院男科门诊就诊者。均为婚后 1年以上、未采取任何避孕措施、性生活正常、精子密度＞ 20 ×10６／ml，a级<25%，a＋ b级精子<50％，排除女方不育原因者。无外伤及遗传性疾病家族史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常。无全身和内分泌疾病；抗精子抗体阴性。

  所有患者精液质量参数按照 WHO《人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册 》第 4版的标准，纳入标准：凡符合本病诊断标准并且精子核蛋白组型半定量值>30%者。所有入选患者治疗前１个月均未服用任何治疗药物，治疗前至少2次以上精液参数分析结果差异无显著性。

1.3.2给药方案 　69例入选患者均口服聚精颗粒（组方：熟地黄１０ｇ，党参１０ｇ，枸杞子１０ｇ，制首乌２０ｇ，制黄精１０ｇ，茯苓１０ｇ，生牡蛎３０ｇ，柴胡10ｇ；江阴天江药业有限公司生产），开水冲成约120 ml／次，早、晚餐后２小时服用，３个月为1疗程。服药期间禁酒。

1.3.3检测内容  精液常规检查，取精前均禁欲３～7d，手淫取精，精液置３６℃恒温箱直至液化，采用DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统（北京航天瑞祺科技发展有限公司），采用 WHO推荐标准 ,测定精液量、精子密度、活动率等。

 精子核蛋白组型转换半定量检测按照实验操作手册完成。判断标准：精子核蛋白组型转换半定量检测值：头部染蓝色精子≤30%。

 RealtimePCR实验  精子细胞收集处理后进行RNA提取，RNA浓度测定后进行逆转录反应检测，用beta-actin引物检测逆转录cDNA 质量

1.4检测结果：

CDY（CDY1和CDY2都能扩增）向前GGACTAGGTGCATCCATCC和逆向CAACAGAGGTATTTTTAACATGG。

1.5疗效标准  治愈：配偶怀孕。显效：配偶虽没有受孕，但治疗3个月后精子核蛋白组型半定量值≤30%，精子活力a＋b级>50%或a级>25%。无效：治疗前后无变化。总有效率＝（治愈例数＋显效例数）/总例数。

1.6统计学处理  采用SPSS11.0软件包进行统计分析，检测数据用x±s表示，自身对照配对ｔ检验比较给药前后各项观察指标的差异，P<0.05被认为差异有统计学意义。 

2结   果

2.1治疗前后资料完整核蛋白组型异常弱精子症患者63例，年龄22～44，平均29.81岁。不育病程 1～12年 ,平均 3. 1年。正常对照组56例。63例完成治疗的患者中，治愈者12例（19%），显效39例（61.9%），无效12例（19%），总有效率达80.9％。

2.2正常对照组与精子核蛋白组型异常组的比较  在63例精子核蛋白组型转换半定量值和精液参数指标中，精子密度有差异性(ｐ<0.05)，而精子核蛋白组型转换半定量值、a级精子、（ａ＋ｂ级）精子和活率均有显著的统计学意义（ｐ<0.01）。见表2。

2.3治疗前后精子核蛋白组型半定量值和精液参数变化  63例患者中，除12例治疗无改善外，其余51例精液质量均有明显改善（表1）。在聚精颗粒治疗3个月后，精子密度治疗前后有差异性（P<0.05），而治疗后精子核蛋白组型半定量值和a级精子、（ａ＋ｂ级）精子、活率等主要精液参数指标，均有显著改善（ｐ<0.01）。部分患者服药后自觉体力明显增强，精力较以前良好，睾丸及阴囊不适有明显好转。见表2。

2.4不良反应  完成治疗的患者中，8例在服用聚精颗粒第1周出现一过性轻度腹泻，用药过程中，仅有部分患者有轻微胃脘不适，但无需停药。余未见其他明显的不良反应。

表2　正常对照组、核蛋白组型异常性弱精子症患者以及采用聚精颗粒治疗前后的比较（x±s）

Table 2  Comparison of normal men and asthenospermia patients with abnormal nucleoprotein transition before and after Jujing granulation treatment（x±s）

与对照组比较：△：p<0.05，＊：p<0.01

与治疗前比较：△：p<0.05，＊：p<0.01

compared with control：△：p<0.05，＊：p<0.01

compared with pre –treatment：△：p<0.05，＊：p<0.01

CDY基因表达结果

       

 A：治疗前；                                B：治疗后

A：Pre-treatment；                            B：Post-treatment

图1  1例核蛋白组型异常患者治疗前后精子头部染色比较图（油镜，×100）

Figure1．Caput stain of sperm (oily microscope, ×100)

3讨论

3．1在精子发生过程中，精子细胞内与DNA结合的体细胞类型组蛋白，逐渐被鱼精蛋白取代，晚期长形核精子细胞和精子内的核蛋白主要为鱼精蛋白[1]。在精子成熟过程中，精子核DNA与鱼精蛋白的结合越来越紧密，最终形成高度浓缩的精子特异性染色质。在漫长的受精过程中（精子在附睾内的转运和成熟，在女性生殖器道内的转运、获能和顶体反应等），精子基因在鱼精蛋白的特殊保护下，紧密浓集，无任何DNA转录，这种取代反应的发生对精子的正常发育和能否受精，无疑具有重要的生理意义[2]。

  在精子发生过程中，如生精细胞内的核蛋白组型转换异常或受阻可导致男性不育或自发性早期流产 [3,4,5]。睾丸内核蛋白组型转换异常，使射出精子携有异常组型的核蛋白，目前可采用组织化学法和电泳法等技术来分析精子的核蛋白组型转换。本研究采用方法是国际认可的苯胺蓝法，是一种实用的可反映精子核蛋白组型转换的检测方法[6]。

3．2深入研究核蛋白组型异常而造成不育或流产，在研究男性不育相关基因时发现CDY基因与精子成熟过程中的组蛋白向鱼精蛋白的转化有关，在生精细胞发育中可能起重要作用，为男性不育的基因诊断和调控提供了新方向[7]。

  CDY是人类Y染色体基因家族唯一表达在睾丸上和男性不育症相关的基因，人类CDY基因在人类精子发生过程中，与鱼精蛋白代替组蛋白转换相关。随着扩增的Y染色体，通过CDYmRNA的后移，证实人类CDY基因出现在Y染色体[8]。在人类Y染色体上，CDY基因有两个明显不同的部分，CDY1和CDY2已经被明确。这两个部分的序列有轻微的不同，每个是多重的几乎完全一样的拷贝基因[8,9]。

  研究提示CDY基因在精子发生过程中具有很重要的作用，而且CDY基因的缺失在AZFc缺失的男性可以导致生精障碍。有研究表明CDY1基因在精子细胞发生的晚期表达[10]。CDY基因表达的异常在精子发生过程中影响鱼精蛋白取代组蛋白的过程，从而导致生精障碍。

3．3聚精方是徐福松教授根据自己的临床体会组合而成，在临床已使用 30多年。该方由熟地、枸杞子、何首乌、党参、生牡蛎、柴胡、茯苓、黄精等中药组成。本方针对肾精亏损 ,后天化生乏源的主要病理特点，依据阳化气、阴化形的理论，以滋肾填精、补脾助运为治疗法则。方中熟地、何首乌、枸杞子等益肾填精，补肾中阴精不足；茯苓、黄精健脾助运，益后天化生之源以供养先天。诸药共用，脾肾同治，共收滋肾化源，添精助育之功。在改善生精功能，提高精液质量，特别是精子活动力方面显示出良好的效果。同时，聚精颗粒还结合了现代药理研究成果，进行针对性用药，即辩病与辩证相结合。如枸杞子、黄精含锌较高；枸杞子还可以提高血睾酮水平；而熟地、何首乌、茯苓均可显著提高人体免疫力[11—13]。

3．4 RealtimePCR技术结合了PCR与DNA探针杂交的优点，提高了特异性和灵敏度，由于是完全闭管检测，因而假阳性率低，实时动态监测克服了终点法的平台效应，提高了试验的准确性、重复性和测定范围[14]。RealtimePCR方法具有良好的稳定性和重复性，在多次重复试验中检测结果一致