地西他滨联合阿霉素逆转白血病K562细胞株多药耐药作用观察

天津市第一中心医院    李静怡

Reversal effect of decitabine and adriamycin on the multidrug resistance of leukemia cell strain K562

LI Jing-yi , DENG Qi, LIU Peng~jiang9 ZHAO Ming-feTig9 LI Yu-ming9 WANG Xue-qian

(1 Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, P. R. China)

Abstract: Objective To observe the reversal effect of decitabine and adriamycin(ADR) on the multidmg resistance of leukemia cell strain K562 and to explore its feasibility to treat leukemia. Methods K562/ADR cells were treated with different concentrations of decitabine and ADR. The impact of cell growth curve was observed by Trypan blue staining. Kil­ler acticity of K562/ADR cell with different concentrations of decitabine or ADR was determined by MTT assay. The con­centrations of P-glycoprotein in cell membrane and of ADR in cells were determined by FCM. Results Obvious reversal effects of DCA + ADR on multidrug resistance in leukemia cell strain K562 were observed. Decitabine and ADR could de­crease the expression of P-glycoprotein in cell membrane, and improve the sensibility of multidrug resistant cell strain K562 to ADR. Conclusions Decitabine and ADR could reverse the multidrug resistance on leukemia cell strain K562.

Key words： leukemia； decitabine; adriamycin； K562/ADR cells

 

近年研究发现,DNA甲基化导致的抑癌基因失 活是恶性肿瘤发生、发展的重要机制之一，其通过表 观遗传学修饰抑制基因转录致基因失活⑴，药物可 逆转其甲基化修饰。因DNA高甲基化广泛存在于 恶性血液病中，故去甲基化成为治疗恶性血液病的 可能方案。白血病化疗主要依靠阿糖胞昔和蔥环类 药物,但易出现耐药和复发，而去甲基化治疗对耐药 和复发的白血病患者有一定疗效。目前，有关去甲 基化药物地西他滨（DCA） +阿霉素（ADR）治疗白 血病的研究少见报道。2009年，我们进行了相关研 究。现报告如下。

1材料与方法

11药物及试剂白血病K562/ADR细胞为本院实 验室保存，在含ADR 1岫ml、10%胎牛血清的1640 培养液中培养，实验前1周用无ADR培养液培养，取 对数生长期细胞进行实验。DCA购自西安杨森公 司;FTTC标记的鼠抗人CD14、HLA-DR及同型对照, 抗人PE-糖蛋白（P-gp）单克隆抗体购自BD公司； MTT购自Sigma公司;ADR购自深圳万乐制药厂。 1.2方法

1.2.1 K562/ADR细胞生长曲线的绘制 将对数 生长期K562/ADR细胞悬浮于含5%胎牛血清的 1640培养液中,接种于6孔培养板，每孔3 x卄个 细胞,终体积4 ml。实验组DCA分别以5、10、20 Wml加入培养体系，各DCA浓度组再设ADR 3、 6、12 gg/ml组;对照组分别加入ADR 3、6、12 gg/

ml，各组均设3孔，同时设3个K562/ADR细胞空白 对照组。各组均置于37 Y、5%CO2饱和湿度培养 箱中培养5 d。实验组、对照组每24 h取样,用台盼 蓝染色，在光镜下计数活细胞数;每孔重复取样3 次,取均值，绘制K562/ADR细胞生长曲线。

1.2.2细胞杀伤活性检测取96孔培养板，实验 组为 ADR + DCA + K562/ADR 细胞,分别设 ADR 3、 6、12 jxg组，每组再设DCA 5.10.20 jig组;对照组 为 ADR + K562/ADR 细胞,分别设 ADR 3、6、12 瞄 组;另设不同浓度ADR、DCA和靶细胞对照孔;每组 均设3孔。以1640培养液调整K562/ADR细胞终 浓度为 2x105/L,每孔 100 口,在 37 *C、5%C（）2 培 养箱中孵育72 h；然后各组离心去上清，加入MTT 20 jil；37 T孵育4 h后离心去上清，再加二甲基亚 砚150貝，在酶联免疫检测仪上检测吸光度（A）值, 重复检测3次,计算细胞杀伤活性。

1.2.3   P-gp的检测 取各组收获的K562/ADR细 胞，以PBS悬浮后，用P-gp抗体标记、流式细胞仪检 测 P-gPo

1.2.4   K562/ADR靶细胞内ADR浓度的检测 取 各组收获的K562/ADR细胞，用4 T冰箱冷却的冰 PBS洗涤3次,再用冰PBS 50讪重悬细胞,并以正 常K562/ADR靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪 检测其细胞内ADR浓度。

1.3统计学方法采用SPSS11.0统计软件，计量 资料以£±,表示，各组数据比较用，检验。p< 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 DCA + ADR、ADR 对 K562/ADR 细胞生长曲 线的影响 各浓度DCA + ADR对K562/ADR细胞 均有抑制作用,72 h后与加ADR组及空白对照组比 较有统计学差异（P<0.01）;随DCA浓度增加，对 细胞的抑制作用增强，以培养72 h后的实验组和加 DCA组明显，各组间比较均有统计学差异（P均< 0.05）。见图 1。

图1 DCA+ADR、ADR对K562/ADR细胞生长曲线的影响 2.2细胞杀伤活性 两组K562/ADR细胞杀伤活 性的比较见表1。

20

万方数据

2.3两组细胞膜P-gp比较 见表2。

 

2.4 K562/ADR靶细胞内ADR浓度 两组K562/ ADR靶细胞内ADR浓度比较见表33讨论

研究表明,DNA甲基化状态（尤其是抑癌基因 的过甲基化）在白血病发生、发展、临床诊断、治疗、 预后评价方面均起重要作用。Roman-Gomez等⑵研 究发现，慢性粒细胞白血病的发展进程与甲基化有 密切关系,慢性期DNA低甲基化程度高于正常人 群，加速期其低甲基化程度更高。El-Shakankiry 等⑶观察了 59例埃及急性髓系白血病患者的P15 和E-cadherin基因甲基化状态,pl5基因甲基化异 常49% ,E-cadherin基因甲基化异常63% ,pl5基因 和E-cadherin基因甲基化均异常40%。在儿童及成 人急性淋巴细胞白血病中，多个抑癌基因启动子区 域甲基化异常提示预后不良。

DCA是2-脱氧胞昔类似物，研究证实其抑制 DNA甲基化的活性是5-氮杂胞昔的30倍。因此， 目前认为DNA甲基转移酶是去甲基化药物作用的 较好靶点。Garcia-Manero等⑷将DCA和丙戊酸用 于白血病患者一、二期临床实验，显示两药有明显的 协同效应。本研究显示.DCA + ADR可明显抑制白 血病K562细胞株生长，降低细胞膜P-gp表达，增加 耐药细胞内ADR浓度，提高ADR对耐药细胞的杀

 

伤活性;且随DCA浓度增大,对耐药细胞杀伤活性 增加。此为临床应用含ADR类的化疗方案+ DCA 治疗复发难治性白血病提供了理论依据,其逆转耐 药性机制有待深入探讨。

参考文献：

⑴于力.DNA甲基化与肿瘤[J].中华内科杂志,2005,44（6） -403­404.

[2]     Roman-Gomez J, Jimenez-Vetaaco A, Agiire X, et al. Repetitive DNA hypomethylation in the advanced phase of chronic myeloid leu- kemia[ J]. Leuk Rea, 2008,32(3) ：487-490.

[3]   El-Shakankiry N, Mossallam GI. pl5(INK4B)and E-cadherin CpG island methylation is frequent in Egyptian acute myeloid leukemia [J]. J Egypt Nail Cane ln»t, 2006,18(3) ：227・232.

[4]     Garcia-Manero G, Kantaljian HM, Sanehez-Gonzalez B, et al.

Phase IZH study of the combination of 5 -aza-2-deoxycytidine with valproic acid in patients with leukemia] J]. Blood, 2006,108( 10): 3271-3279.                                                           (收稿日期：2010-03-12)