缺乏患儿基因检测结果，依旧有希望进行精准产前诊断

前言：遗传性疾病的产前诊断通常需要先对家族中先证者（患有遗传病的患者）进行基因检测，发现致病基因突变位点之后，家族中有再孕患儿风险的孕妇需在一定孕周进行绒毛膜或者羊水穿刺，进行产前诊断确定胎儿是否再次患有类似疾病。然而，有些情况下，家族中的先证者出生不久后因疾病过于严重早期夭折（死亡）而未能进行明确基因检测，这时为家庭提供产前诊断将会困难重重。

北京大学第一医院皮肤科遗传组长期进行遗传性皮肤病的致病基因产前诊断，积累了丰富的基因检测及产前诊断的经验。在缺乏先证者基因检测结果的情况下，也可以通过直接对携带者父母进行基因检测，反向推断先证者基因缺陷，从而成功为家庭再孕提供精准的产前诊断。下面来自于北京大学第一医院皮肤科林志淼等遗传学皮肤病研究团队成功案例的论文详细描述了检测的过程。

火棉胶样婴儿（collodion baby，CB）是指新生儿出生后出现紧张性胶样膜状物质覆盖全身皮肤，可伴有全身皮肤潮红。由于全身皮肤紧张牵拉，可能会导致患儿出现眼睑外翻、口唇外翻、毛发稀少、耳部软骨畸形及指趾屈曲等畸形[1]。多数新生儿在出生一个月左右可褪去这层膜状物，但部分CB可因感染、水电解质紊乱等缘故早夭。CB可见于多种遗传性皮肤病，最常见病因为隐性遗传性先天性鱼鳞病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI）[2]。产前诊断是指在明确患者或家庭携带者的致病基因突变位点之后，在怀孕过程中通过绒毛膜穿刺或者羊水穿刺获取胎儿组织标本进行相应基因突变位点分析，确定胎儿是否患有家族遗传性疾病[3]。我们通过候选基因排查的方法，在两对分娩过火棉胶样婴儿的夫妻中成功进行产前诊断。

对象与方法

一、 对象

家庭1，1对健康夫妇由于2次分娩过CB于我院遗传性皮肤病门诊就诊咨询。2例CB均在出生后发现全身覆盖透亮胶样膜状物质，伴有眼睑外翻及全身潮红，3周左右膜状物质开始脱落，出现部分糜烂面及渗出，同时伴发皮肤化脓感染及发热，两例患儿最后均于出生1个月左右死于败血症。家庭2，1对健康夫妇在半年前分娩过1例CB就诊。该婴儿出生后亦出现全身潮红及紧张性膜状物，伴眼睑外翻、毛发稀少。出生数天后，因喂养困难、继发感染及水电解质紊乱，在一周内死亡。两个家庭CB病史均为患儿父母自述（均未能提供患儿照片），CB由出生医院皮肤科大夫诊断。两对夫妻皮肤均完全正常，未见任何鱼鳞病样皮损，否认近亲结婚，否则家族中类似患者。由于胎儿均出生不久后死亡，我们未能获取任何胎儿组织标本。

二、 方法

1 DNA的提取：取两个家庭患儿父母外周血各5ml，2％EDTA抗凝，以低渗溶血以及酚－氯仿抽提法提取基因组DNA。

2 PCR扩增TGM1、NIPAL4、ALOX12B基因以及DNA测序： 根据基因序列设计特异性引物，用于扩增上述基因编码区及其侧翼序列。根据火棉胶样婴儿致病基因的出现的比率，在患儿父母中逐个检测可疑致病基因，直到父母双方均在同一致病基因中发现致病突变位点。利用Mutationtaste在线软件（http://www.mutationtaster.org/）预测突变位点的致病性，并在200个无关正常DNA中排查所发现的突变位点。

3 产前诊断：家庭1，患儿母亲在孕11周时进行绒毛膜穿刺取样，提取胎儿绒毛膜组织DNA后进行PCR扩增TGM1基因致病位点外显子并测序。家庭2，患儿母亲在孕18周时进行羊水穿刺取样，部分羊水细胞用于直接提取DNA，扩增ALOX12B基因致病性位点外显子并测序；部分羊水细胞用于培养，待羊水细胞贴壁后换液，去除悬浮母血污染，并提取培养羊水细胞DNA，再次进行ALOX12B基因致病性位点外显子扩增并测序，排除母血污染，确保产前诊断结果的准确性。

  结  果

一、致病基因突变位点

   我们在家庭1的患儿父亲基因组DNA中检测到TGM1基因c.C427T杂合突变，该突变导致编码的转谷酰胺酶蛋白1出现p.Arg143Cys氨基酸替代改变，该突变位点高度保守，既往曾经在板层状鱼鳞病患者中报道过；家庭1的患儿母亲检测到TGM1基因c.1106delG杂合突变，导致编码蛋白出现p.G369fsX13的移码突变，并在突变氨基酸下游第13个氨基酸出现提前终止密码子，导致截短蛋白的出现。家庭2的患儿父母的TGM1、NIPAL4基因均未发现致病性突变。患儿父亲ALOX12B基因发生c.1463G>A杂合突变，导致其编码蛋白发生p.Arg488His氨基酸替代改变；母亲ALOX12B基因发生c.1642C>T杂合突变，导致编码蛋白发生p.Arg548Trp氨基酸替代改变，这两个突变位点均在火棉胶样婴儿中报道过，为高度保守的氨基酸位点。所有4个突变位点经Mutationtaste预测结果均为致病性（disease causing）,且未见于200个正常人。

二、 产前诊断

家庭1患儿母亲孕11周绒毛膜穿刺取样后，经过PCR扩增及DNA测序后发现，胎儿不带有父母双方任何一个TGM1基因的致病性突变位点，确定为健康胎儿。家庭2母亲孕18周羊水穿刺取样进行PCR扩增及DNA测序后发现，胎儿的ALOX12B基因带有父源性突变位点c.1463G>A，不带有母源性突变位点c.1642C>T，羊水细胞培养后再次重复检测结果一致，确定胎儿为健康携带者。经随访，两例胎儿出生后均为健康新生儿。

讨  论

CB可见于多种遗传性皮肤病，其中以ARCI最为多见[1]。此外，CB还可以见于多种综合征型鱼鳞病及非综合征型鱼鳞病，代谢性疾病如戈谢病，以及外胚叶发育不良等其他疾病[4, 5]。CB会因本身疾病不同而导致最终出现完全不同的临床转归，轻则可以完全自愈或仅出现轻微的皮肤干燥脱屑（自愈型火棉胶样婴儿）[6]，重则可以出现板层状鱼鳞病的严重临床表型[2]。然而在出生早期，CB会由于皮肤屏障功能严重受损而出现经皮水分丢失明显增加，从而出现体温调节失衡、水电解质紊乱，并且由于皮肤受损而增加感染机会，因此在该时期，若护理不好，CB的致死率很高[1]。本研究中两个家庭的三例CB患儿均在出生不久后死亡，与CB早期的高死亡率及当地医院缺乏护理经验可能有关。由于患儿早夭，未能获取皮肤组织标本用于病理及组化检测，并且无法了解疾病进一步临床表现，因此当时两个家庭的火棉胶样婴儿均未能获得疾病的最终诊断。

遗传性疾病的产前诊断通常需要先在先证者或者患者中确定致病基因突变位点，然后对具有再发风险的胎儿羊水细胞或者绒毛膜组织标本进行相应位点检测，确定胎儿的基因型，从而明确胎儿是否患病[3, 7]。由于本研究中两个家庭均未能获取到患者DNA，因此仅能从既定为携带者的父母DNA中寻找致病性突变位点。由于CB最常见于ARCI，因此我们首先拟对两个家庭患儿父母进行引起ARCI的6个致病基因进行排查。因缺乏特征性的临床表型来从6个致病基因中进行挑选，我们根据文献检索，根据已报道引起ARCI的6个基因所占比例大小排序，从高到低对6个基因逐一筛查（TGM1>NIPAL4>ALOX12B>CYB4F22>ABCA12>ALOXE3）[8]，直到确定致病基因。仅当患儿父母双方在同一基因中均发现致病性突变位点时，我们认为该基因为引起家庭中火棉胶样婴儿的致病基因。两个家庭中所发现的突变位点中有三个（TGM1的c.C427T，ALOX12B 的c.G1463A及c. C1642T）既往曾在ARCI病例中报道过。未报道过的突变位点（TGM1的c.1106delG突变，）为引起截短蛋白的移码突变，此类突变可以引起所编码蛋白结构明显变短或者改变，且该突变未见于200个同种族正常人群，因此极为可能是致病性突变位点。由于两对夫妇均为致病基因携带者，因此再次怀孕出现CB的可能性为25%，我们建议在孕期进行产前诊断。

产前诊断可在孕9-11周时进行绒毛膜穿刺取样或者在孕16-20周时进行羊水穿刺取样用于染色体或者DNA分析。绒毛膜穿刺取样优点是较早可以获知胎儿是否患病，从而减少孕妇不必要的痛苦和心里负担，但与羊水穿刺相比穿刺难度略高、风险较大，且绒毛膜细胞培养困难，怀疑有母血或母体组织污染时难以进行后期验证。而羊水细胞培养相对容易，后期排除母血污染较易实现。两个家庭根据情况分别选择了不同的胎儿标本取样方式。我们的产前诊断结果均准确无误。

尽管本研究最终成功为两个家庭提供了产前诊断，但是在候选致病基因较多的情况下，基于第一代测序（Sanger测序）方法的检测手段将会耗时、耗力，且花费成本较大。近年来，基于大规模平行测序（massively parallel DNA sequencing）的第二代测序成本不断降低[9, 10]，将大量候选基因集中在一个反应体系或者芯片中，进行捕获及高通量测序，将大大降低人力及物力成本，并且加快检测速度。今后极有可能替代第一代测序用于临床及实验室检测。我们实验室与华康基因研究所合作，已经开发出包含遗传性鱼鳞病所有已报道的致病基因编码序列的捕获体系用于二代测序，目前正在进行敏感性及特异性验证。

图1  患者父母测序图  1a示家庭1患儿父母TGM1基因分别发生c.C427T及c.1106delG杂合突变；1b示家庭2患儿父母ALOX12B基因分别发生c.G1463A及c.C1642T杂合突变。