联合多次检测ACA和抗beta2-GPI抗体在复发性流产中的诊断价...

联合多次检测ACA和抗b2-GPI抗体在复发性流产中的诊断价值上海市第一妇婴保健院生殖免疫科鲍时华

  中国实用妇科与产科杂志,2007;23(10):760-762

[摘  要] 目的 探讨联合多次检测抗心磷脂抗体（ACA）和抗β2-糖蛋白抗体（抗β2-GPI抗体）对自身免疫型复发性流产的临床诊断价值。方法 应用酶联免疫吸附(ELISA)法，对417例复发性流产患者血清中的ACA及抗β2-GPI抗体进行检测。每隔3周一次，连续14次。结果  患者抗磷脂抗体总阳性率达21.8%，其中ACA阳性率为18.7%、抗β2-GPI抗体阳性率为7.7%、ACA和抗β2-GPI抗体双阳性率为4.6％。自身抗体阳性检出率随检测次数的增加而逐渐增加：在确诊的91例抗磷脂抗体阳性患者中，测定4次阳性率仅为68.13%；5次阳性率为81.32%，与4次阳性率比较差异有显著性（c2=4.189，p=0.041）。 结论 ACA和抗β2-GPI抗体联合多次测定，可以提高自身免疫型复发性流产患者抗磷脂抗体检测率，减少漏诊率。为了提高自身免疫型复发性流产的诊断率，建议临床上对抗磷脂抗体的测定次数，应根据病情需要进行5次以上测定。

[关键词] 流产，复发性；抗心磷脂抗体；抗β2-GPI抗体

复发性流产( recurrent spontaneous abortion, RSA) 是指自然流产连续发生3次或3次以上者。约50～60％左右与免疫相关，其中48.3%属同种免疫型；12.8%为自身免疫型，由抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome, APS)引起[1]。APS为自身免疫性疾病，是由两类抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies, APA)所致，一类抗体作用与磷脂，主要包括抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibodies, ACA)、狼疮抗凝物(lupus anticoagulant, LA)；另一类抗体作用于磷脂结合蛋白，主要是抗β2-GPI抗体(Anti-β2-glycoprotein I antibody)，通过干扰依赖磷脂的各种凝血与抗凝血因子的功能而导致血栓。临床上表现有复发性静脉血栓、动脉血栓、血小板减少及习惯性流产等。1998年在日本召开的第九次国际抗磷脂抗体讨论会通过的国际分类诊断标准中，APS的诊断标准包括临床表现和实验室检查两部分，如果存在一条以上临床表现和一个以上实验室检查异常则可诊断为APS。某些感染性疾病患者会出现APA一过性阳性，这种因感染引起的短暂的APA阳性并不会引起APS的临床症状，所以应强调诊断APS的实验室标准是两次以上、且每次间隔至少6周检测发现APA阳性才能确诊。但目前临床上对复发性流产患者ACA通常只进行1～2次的检测，导致ACA在复发性流产患者中的检测率，各家报道不一，最高可达50%，最低仅为5%，误诊率、漏诊率均较高。为提高自身免疫型RSA诊断的准确率，我们对RSA患者血清ACA和抗β2-GPI抗体，进行联合多次测定，探讨联合多次测定ACA和抗β2-GPI抗体对自身免疫性RSA的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象  2005年1月～2007年4月在上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科复发性流产专家门诊就诊的417例有复发性流产史的患者，排除解剖、染色体、内分泌、感染等因素。年龄24～43（30.70±3.84）岁，流产次数2~7(2.10±0.67)次。

1.2实验方法  两组均每隔3周取肘静脉血3ml，连续14次。采血后离心分离血清，置-80℃保存。一次性对每份待检血清采用ELISA 法检测抗β2-GPI抗体和ACA。抗β2-GPI抗体和ACA测定试剂购自Phadia公司(Varelisa, Michigan, USA)。

操作和结果判断均按试剂盒说明书进行。血清或血浆标本预先用Serum/Plasma dilution进行1:101稀释，包被板用洗板液洗板一次后，各孔依次加入标准品、质控品和待测样品100mL，室温下振荡孵育30min，洗板三次；加入标记抗体100mL，室温下振荡孵育30min，再洗板三次；每孔加入100mL TMB，室温下避光振荡孵育10min，每孔加入50mL终止液，在波长450nm处读取OD值，用直线拟合方式计算各样品浓度值。阳性判断标准：抗β2-GPI抗体大于7.8U/ml(98% Percentile)，ACA大于14.7 U/ml(98% Percentile)。

1.3统计学方法 用SAS6.12统计学软件对多个样本率进行比较（卡方检验），P<0.05有统计学意义。

2  结果

2.1       ACA和抗β2-GPI抗体检测情况

在417例复发性流产患者中连续12次检测血清中ACA的阳性率为18.7%(78/417)，抗β2-GPI抗体的阳性率为7.7%(32/417)，ACA+抗β2-GPI抗体的阳性率为4.6%(19/417)，ACA和/或抗β2-GPI抗体的阳性率可达到21.8%(91/417)。经统计学分析，各组间(ACA、抗β2-GPI抗体、ACA+抗β2-GPI抗体、ACA和/或抗β2-GPI抗体组)的阳性率有统计学差异(c2=76.447，p=0.001)。

2.2 连续多次检测ACA和抗β2-GPI抗体的情况

连续检测3次的阳性率仅为12.47%，12次可提高至21.82%（见表1），12次后再增加检测次数不能提高阳性率。经统计学分析，各组间（3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次）的阳性率有统计学差异(c2=23.666，p=0.005)。

表1 连续检测抗磷脂抗体阳性的检出率

注：各组间比较，c2=23.666，p=0.005

在确诊的91例抗磷脂抗体阳性患者中，测定4次阳性检出率为68.13%；5次阳性检出率则达到81.32%（4次与5次比较, c2=4.189，p=0.041）；7次阳性检出率为90.11%；大于7次阳性检出率则达93.41%以上，随检测次数的增加，漏诊率逐渐降低（见表2）。

表2  91例抗磷脂抗体阳性在不同检测次数中的漏诊率与确诊率

注：各组间比较，c2=146.648，p=0.001; 4次vs. 5次, c2=4.189，p=0.041.

3  讨论

ACA是自身免疫性抗体，自身免疫因素在习惯性流产患者中的发病作用已被证实[2]。目前已知ACA可能通过以下途径导致流产发生[3,4,5]：①ACA作用于滋养层表面的磷脂依赖抗原，影响其粘附、融合和分化过程，使合体滋养层细胞形成不足，造成子宫对胚胎接受性降低，维持妊娠的胎盘激素如hCG、hPL分泌减少；②干扰血栓素A2和前列腺环素的平衡，导致血小板聚集，形成微血栓，引起胎盘梗死，造成不良妊娠结局；③ACA作用于胎盘血管内皮细胞膜的磷脂上，引起胎盘血栓形成和血管收缩，胎盘血流量减少，或引起胎盘血管炎，致使胎儿氧供及营养不足而死亡；④ACA有干扰钙依赖磷脂结合蛋白-V的作用，钙依赖磷脂结合蛋白-V是一种抗凝特性的磷脂结合蛋白，有研究发现ACA阳性的反复流产患者钙依赖磷脂结合蛋白-V明显减少。其主要的病理改变为内皮损伤、血小板聚集、高凝状态，最后导致血管内血栓形成。

ACA在复发性流产患者中的检测率，各家报道不一，最高可达50%，最低仅为5%，我们以往的报道是13.5%和14.29%[6,7]，有报道在健康人群中检测率可达5%。这种现象的出现可能是由于诊断标准的不规范，导致抗心磷脂抗体检测的漏诊和误诊。日本Sappora 国际研讨会发布《关于APS的初步分类诊断标准的国际共识声明》中明确规定抗心磷脂抗体的检测至少间隔6周的2次或2次以上发现阳性才可诊断为APS[8]。由于抗磷脂抗体的检测受很多因素干扰，如急性感染、高热等状态可以使ACA出现一过性假阳性，故抗磷脂抗体的检测应避开急性感染、高热期，且一次检测阳性不能认定为阳性。因此如何提高抗心磷脂抗体检测的准确率是临床上迫切需要解决的问题。

ACA与磷脂的免疫病理反应是通过β2-GPI而起作用的，近年来研究[9]发现一些APS患者ACA呈阴性，而抗β2-GPI抗体呈阳性，抗β2-GPI抗体也能够通过与β2-GPI结合发挥与ACA相似的病理作用。b2-GPI又称载脂蛋白H，由肝细胞合成，是血浆中含量较丰富的一种单链糖蛋白，相对分子质量为50000，在血浆中与脂蛋白结合，其第1、2、5功能区有大量带正电荷的氨基酸序列，与带阴离子磷脂的物质结合后，b2-GPI将其隐藏的抗原表位显露，导致抗b2- GPI抗体的产生[10]。体外试验发现[11]：b2-GPI可能具有天然的抗凝作用，抗b2-GPI抗体和带阴离子磷脂结合后可通过多种机制导致血管损伤，形成血管内皮细胞的促凝状态，血小板向内皮细胞粘附、聚集增多，干扰凝血因子和抗凝因子之间的平衡，最终可导致血栓形成。一般认为其与血栓的相关性要比ACA强[12]。因此，联合检测抗β2-GPI抗体和ACA可增加APA在RSA中检测的准确性。本研究结果显示：ACA阳性仅占18.7%（78/417），抗β2-GPI抗体阳性者占7.7%（32/417），ACA和抗β2-GPI抗体双阳性占4.6%（19/417），ACA和/或抗β2-GPI抗体总阳性率为21.8%（91/417）。所以，为提高复发性流产患者APA的检测率及准确率，常规联合检测ACA和抗β2-GPI抗体很有必要。

我们多次检测发现：连续检测3次的阳性率仅为12.47%，随着检测次数的增多，阳性率逐渐增高，12次检测阳性率可达21.82%。第13、14次阳性率与第12次的一致（21.82%），连续检测12次后，再增加检测次数已不能提高阳性检出率。在确诊的91例APA阳性患者中，测定4次阳性检出率为68.13%；5次阳性检出率则达到81.32%（4次与5次相比, c2=4.189，p=0.041）；7次阳性检出率为90.11%；大于7次阳性率达93.41%以上，可见随检测次数的增加，漏诊率逐渐降低。因此，为减少APA检测的漏诊率和误诊率，建议复发性流产自身抗体病因筛查，应在排除急性感染等干扰因素的条件下，每3周检测1次，至少连续检测5次以上，有助于提高APA检出的准确率。