中药用于逆转慢性粒细胞白血病加速期

HLJDT通过抑制HO-1发挥逆转CML加速期的作用

 

刘尚勤1 谭细友2蔡惠丽1李倩1 荣雯玉1曾庆斌1 金小君1 马梓3武汉大学中南医院血液内科刘尚勤

武汉大学中南医院血液科 1，中医科 3 湖北 武汉 430071

上海道培医院移植科 2 上海 200240

 

摘要  目的 探讨黄连解毒汤（Huang-Lian-Jie-Du-Tang, HLJDT）对慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）加速期的治疗作用，以及HLJDT对血红素加氧酶-1（HO-1）表达的影响。方法 通过对一例CML的患者口服HLJDT治疗6个月的观察，经外周血检查和骨髓穿刺分析治疗前后外周血象和骨髓象的变化，使用流式细胞术分析HLJDT和黄芩素对CML细胞系K562的活细胞计数的影响，行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测患者骨髓单个核细胞HO-1基因的表达和蛋白印记检测经黄芩素处理后K562细胞HO-1蛋白的表达水平。 结果 口服HLJDT能有效地治疗CML加速期， 可明显降低骨髓和外周血原始粒细胞和早幼粒细胞数，使疾病重新回复到慢性期；并且能降低体内肿瘤细胞HO-1基因的表达；在体外，HLJDT能抑制K562细胞的增殖；且HLJDT的主要活性成份之一黄芩素亦有相同的作用，也能下调HO-1蛋白的表达。 结论 HLJDT具有治疗CML加速期的作用，其作用机理与抑制HO-1基因和蛋白的表达有关；因此，HLJDT具有潜在的临床应用价值。

关键词 慢性髓细胞性白血病; 血红素加氧酶-1; Bcr/abl融合基因; 黄连解毒汤; 黄芩素

中图分类号 R733.72           文献标识码 A

HLJDT Reverses CML Accelerated Phase via Down-regulation of HO-1 Gene Expression

LIU Shangqin1, TAN Xiyou2, LI Qian1, CAI Huili1, RONG Wenyu1  

ZENG Qingbin1 JIN Xiaojun 1 MA Zi3

 1Department. of Hematology, 3 Department of Chinese Traditional Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071

2Department. of Stem Cell Transplantation, Shanghai Daopei Hospital, Shanghai 200240

课题来源：国家自然科学基金资助项目（30670908）

作者简介：刘尚勤，男，1963-，副教授，医学博士，主要从事血液肿瘤、特别是多发性骨髓瘤的研究

通讯作者：马梓，女，1963-，副主任医师，主要从事中药抗癌研究

 

Abstract

Objective: To explore the effects of Huang-Lian-Jie-Du-Tang (HLJDT) on accelerated  phase of chronic myeloid leukemia (CML) and the inhibitory effects of HLJDT and its component on heme oxygenase-1 (HO-1) gene and protein expression. Methods: Oral HLJDT was taken daily for half a year to treat one CML patient in accelerated phase. The blood smear and bone marrow aspiration were examined before and after HLJDT administration. Flow cytometry was used to determine the viable cell number reduced by both HLJDT and baicalein, an active component in HLJDT, in K562 cell line. RT-PCR was used to detect HO-1 gene expression inhibited by HLJDT in bone marrow mononuclear cells. Western blot was used to examine the HO-1 protein expression inhibited by baicalein in K562 cells. Results: HLJDT could reverse the CML patient from accelerated phase to chronic phase through downregulation of HO-1 gene expression in bone marrow mononuclear cells and inhibite K562 cell proliferation in vitro. It was further found that baicalein could suppress the proliferation of K562 cell and their HO-1 protein expression. Conclusion: HLJDT has ability to reverse accelerated phase to chronic phase of CML. The mechanism may be involved in the down regulation of HO-1 gene and protein expression by both HLJDT and baicalein treatment. Thus, HLJDT may have a potential in the treatment of patients with CML in aggressive phases.

Key Words:  Chronic myelogenous leukemia; Heme oxygenase -1; Bcr/abl fusion gene; Huang-Lian-Jie-Du-Tang; Baicalein

 

慢性粒细胞白血病（CML）的特点是存在9号染色体abl基因与22号染色体bcr基因的相互移位，形成一个异常的bcr/abl融合基因，该融合基因编码一个融合蛋白，具有酪氨酸激酶的活性。Bcr/Abl融合蛋白的持续激活会导致造血前体细胞恶性变，使细胞的增殖能力提高、粘附能力下降和凋亡能力降低。CML常在短时期内发生转变，进入加速期和急变期，导致疾病进展，预后差。目前，CML的根治性治疗是异基因干细胞移植[1]，常因寻找合适的供体困难而应用受限；另外Bcr/Abl融合蛋白抑制剂伊吗替尼（Imatinib）是治疗CML的主要药物，但该药不仅价格昂贵，而且少数病人还会发生耐药。有报道指出，HO-1基因的过度表达参与CML细胞耐药过程的形成[2]。HO-1是一个应激诱导蛋白，催化血红素分解为一氧化碳（CO）、胆绿素和铁，通过这些代谢产物调节各种细胞的凋亡[3]。在bcr/abl基因致肿瘤形成的过程中，细胞常伴有HO-1基因的持续表达。Bcr/Abl融合蛋白是HO-1基因的转录因子，能增加HO-1的表达水平 [4] 。通过HO-1分子，Bcr/Abl发挥细胞的抗凋亡作用。因此，我们推测，能够抑制HO-1的表达的药物，可能具有潜在治疗CML的临床应用价值[4]。

HLJDT是传统中药中最具代表性的清热解毒方剂，由四种植物成分组成，它们分别是黄连、黄芩、黄柏和栀子。在研究多发性骨髓瘤的过程中，我们发现HLJDT具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，而发挥这种作用的重要成分是黄芩中所含的黄芩素。黄芩素的作用机理主要是通过抑制NF-kB的信号传导途径，降低IL-6和抗凋亡基因xiap的表达 [5] 。由于CML的进展与细胞增殖能力增强和凋亡受抑制有关，而HLJDT不仅具有抑制细胞增殖和诱导凋亡作用，而且价格低廉，服用方便。为此，我们观察了HLJDT对CML加速期的影响，并探讨了HO-1基因和蛋白的表达与HLJDT作用的关系。

 

                                                                                    1. 材料与方法

1.1细胞系和培养条件：费城染色体阳性的CML细胞系K562细胞培养在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基内，5%CO2，37℃条件下培养。为了抑制HO-1的表达，黄芩素购于日本东京和光公司， 经DMSO稀释后， 以不同的浓度处理K562细胞，并用DMSO作为对照，培养条件是37℃，5%CO2。

1.2传统中药的配治：HLJDT是由黄连2克、黄芩3克、黄柏1.5克和栀子2克组成，四种成分均购于日本东京津村公司，为分析纯，根据文献提取HLJDT 5。口服中药方剂的配制，HLJDT每日一付，水煎，分三次口服，每次100毫升。

1.3分离CML骨髓单个核细胞：经中南医院伦理委员会批准，病人签署知情同意书后，分别在治疗前和治疗后通过骨髓穿刺术获得骨髓液。经淋巴细胞分层液分离骨髓单个核细胞，细胞计数调整到1×106/ml，悬浮于Trizol中，-80 ℃保存备用。

1.4流式细胞仪用于活细胞计数：K562细胞与浓度为0～200 ng/ml的HLJDT 或0～50 mM的黄芩素共同培养后，应用流式细胞仪（Epics Elite ESP）计算活细胞数和死细胞数5。

1.5蛋白印迹：1×106/ml K562细胞经PBS洗两次后，经细胞裂解液裂解。此后的步骤按文献报道进行5 。使用的一抗为：抗HO-1（Santa  Cruz）（1：1000）和b-actin（Santa Cruz）（1：5000），二抗为：HRP标记鼠抗兔IgG（1:1000）。

1.6 RT-PCR：取骨髓液2 ml，总RNA的抽提和逆转录反应按试剂盒说明书进行。引物系列：HO-1上游:5- atgacaccaaggaccagagc-3,下游： 5- gtgtaaggacccatcggaga-3，扩增片段长度为153 bp ；同时设置 b-actin作为内参照，上游：5-ggacttcgagcaagagatgg-3，下游： 5-agcactgtgttggcgtacag，扩增片段长度为234 bp。

1.7统计学分析：Student t 检验用于统计学处理，显著性差异为P<0.05(*) 或P<0.01 (**) 。

 

                                                                                 2.  结果

2.1 HLJDT对CML加速期的逆转作用：我们观察了一例口服HLJDT治疗的CML加速期患者的疗效。患者，男性，因外周血白细胞计数增高6月，在外院查bcr/abl基因阳性，遂确诊为慢性粒细胞白血病慢性期。2008年7月，因乏力，活动后心慌，来我院就诊。体检示：贫血貌，脾肿大；血常规示：白细胞（WBC）27 G/L、血红蛋白（HGB）60 g/L、血小板（PLT）780 G/L；外周血细胞学：原始细胞2%、早幼粒细胞2%；骨髓细胞学：原始细胞5%、早幼粒细胞21%、中幼粒细胞8%、晚幼粒细胞9%。根据标准，本病诊断为慢性粒细胞白血病加速期。患者仅选择HLJDT口服治疗，日煎一剂，分三次口服，每次100毫升。连续服用半年后复查结果如下：患者仍贫血貌，脾脏未触及；WBC 4.5G/L、HGB 50 g/L、PLT 240G/L；外周血细胞学：未见原始细胞，早幼粒细胞占1%；骨髓细胞学：原始细胞1%、早幼粒细胞5%、中性中幼粒细胞22%、中性晚幼粒细胞23%； bcr/abl基因仍阳性；诊断为慢性粒细胞白血病慢性期。治疗前后骨髓象的变化如图1A，白细胞计数的变化如图1B，血小板计数的变化如图1C。以上结果表明，口服HLJDT能逆转CML的加速期。

 

图1.  CML患者口服HLJDT治疗前后骨髓象和外周血象的变化。

Fig.1. The results of bone marrow aspiration and complete blood counts were examined before and after oral HLJDT was taken by a patient with CML in accelerated phase for half a year.

 

2.2 HLJDT对骨髓单个核细胞HO-1表达的作用：有报道指出，CML发生进展和耐药时，往往伴有新的基因突变或某些基因过度表达，其中最重要的基因之一就是HO-1。HO-1是bcr/abl融合基因所控制的靶基因， 在CML治疗过程中，HO-1失去控制而过度表达时，预示病情进展。为明确本例患者口服HLJDT后发生病情逆转是否与HO-1表达水平的降低有关，我们比较了治疗前后，患者骨髓单个核细胞HO-1基因表达水平的变化。RT-PCR检测发现，HLJDT治疗前后骨髓单个核细胞的b-actin基因表达水平无明显变化，而HO-1基因的表达水平明显降低（图2）。因此，HLJDT逆转CML加速期与下调Bcr/Abl蛋白控制的靶基因HO-1有关。

图2. RT-PCR 检测HLJDT治疗前后CML白血病细胞HO-1基因表达水平。

Fig.2 HO-1 gene expression was detected by RT-PCR in the CML patient treated with or without oral HLJDT

 

2.3 HLJDT及其主要活性成分黄芩素对K562细胞增殖的影响：为了进一步证实HLJDT对CML的抑制作用，在浓度为25～200ng/ml的范围内，体外培养的K562细胞经HLJDT处理后，可观察到HLJDT对K562细胞的生长有抑制作用，而这种抑制作用呈剂量和时间依赖性（图3A），与对照组相比，差异具有显著意义（* P<0.05， ** P<0.01）。在HLJDT中，对肿瘤细胞增殖发挥抑制作用的主要成分是黄芩素[5]。因此，我们观察了黄芩素对K562细胞增殖的抑制作用， 在浓度为6.25～50mM范围内，黄芩素对K562细胞增殖的抑制作用也呈剂量和时间依赖性（图3B），与对照组相比，有显著差异（* P<0.05，** P<0.01）。 以上结果表明，HLJDT和其活性成分黄芩素对K562细胞的体外增殖具有抑制作用。

图3. HLJDT和黄芩素在体外对K562增殖的影响

Fig.3 Effects of HLJDT and baicalein on the proliferation of CML cell line K562 in vitro.

 

2.4黄芩素对K562细胞HO-1蛋白表达的影响：K562细胞表达HO-1，HO-1表达的增加会降低K562细胞对化疗药物的敏感性 [2] 。 为了进一步探讨黄芩素对K562细胞表达HO-1的影响，蛋白印迹用于检测黄芩素治疗前后HO-1蛋白表达水平的变化。结果发现：K562细胞经黄芩素处理12小时后，b-actin蛋白的表达水平无明显变化，而HO-1蛋白的表达水平明显降低（图4）。因此，黄芩素能抑制K562细胞HO-1蛋白的表达。

图4. 黄芩素对K562细胞表达HO-1蛋白的影响

Fig.4 Effects of baicalein on HO-1 protein expression in K562 cells

 

                                                                                  3. 讨论

    CML是由9号和22号染色体发生易位，形成Bcr/Abl融合基因所致。靶向基因分子，如伊吗替尼，是治疗CML的重要手段。在临床上使用伊吗替尼治疗CML的过程中，少数病人将发生耐药，导致治疗的失败，最终会使疾病进入加速期和急变期。因此，只有深入阐明CML发生耐药的分子机理，并寻找到新的治疗途径，才能更好地控制甚至逆转本病的进展。

    HO-1是一个应激诱导的蛋白，它的功能是分解血红素分子，并参与调节多种肿瘤细胞的增殖 [6] 。 在CML，白血病细胞持续、过度表达HO-1基因和蛋白，其表达水平受bcr/abl融合基因的调控。因此，CML细胞持续、过度地表达HO-1与细胞形成对伊吗替尼耐药有明显关系[2]。我们推测：通过抑制HO-1基因的表达，能阻断CML的进展。因此，HO-1可作为一个新的靶向治疗分子用于控制疾病的进展。

     HLJDT在我国临床应用已有上千年的历史，其主要功效是清热和解毒。通过研究，我们发现，在体外，HLJDT对骨髓瘤细胞有明显的抑制作用[5]，但HLJDT对CML的抑制作用尚未见报道。本文通过对一例CML加速期患者服用HLJDT的临床效果观察发现，长期口服HLJDT能降低骨髓中原始细胞和早幼粒细胞的数量，逆转CML加速期，使其重新回到慢性期，具有与Bcr/Abl靶分子相同的功效，但没有发现使bcl/abl基因转阴的作用。进一步分析发现，在体外，HLJDT能直接抑制K562细胞系的增殖，在体内，口服HLJDT能抑制CML细胞表达HO-1基因。

黄芩素是HLJDT发挥抑制作用的的重要活性成分[5]，本实验发现黄芩素除能抑制K562细胞的增殖外，还能降低K562细胞表达HO-1蛋白。还有的研究发现，黄芩素还能诱导K562细胞的凋亡[7]。黄芩素能抑制肿瘤细胞内多种信号传导途径[5, 8, 9]，包括MAPK、PI3K/Akt和NF-kB。推测黄芩素可能还具有抑制Bcr/Abl酪氨酸激酶的活性，通过抑制NF-kB信号途径，使其转录活性降低，HO-1基因和蛋白的表达降低，从而使HLJDT发挥逆转CML加速期的作用。

综上所述，由于黄芩素对CML肿瘤细胞内Bcr/Abl—HO-1信号传导轴的抑制作用，使传统的清热解毒方剂HLJDT具有逆转CML加速期的功效。目前，我们正在对更多的病例进行观察，并将探讨黄芩素对Bcr/Abl酪氨酸激酶活性的影响。 由于本方剂价格低，服用方便，HLJDT有望成为预防和逆转CML进展的有效药物。

 

 

参考文献

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