牙龈卟啉单胞菌HmuY在慢性牙周炎免疫应答中作用

慢性牙周炎（chronicperiodontitis，CP）是以牙周支持组织（包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质）破坏为结果的慢性、非特异性、感染性疾病，是口腔两大主要疾病之一，也是导致成人牙齿缺失的主要原因。牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）是牙周病尤其是慢性牙周炎活动性病损区和深牙周袋中最主要的优势菌之一。P.gingivalis属于G-菌，具有众多毒力因子，可导致牙周组织的破坏，并具有侵入牙龈上皮细胞、免疫细胞的能力，使之能在宿主细胞中传播和扩散到其他组织。

在慢性牙周炎炎症过程中，P.gingivalis具有在微环境下逃避宿主的免疫反应、获得营养的能力，其生存、增殖与牙周炎的发生发展直接相关。由于血红素是P.gingivalis发育所必需的营养物质，因此血红素的吸收对该类细菌的生存和感染至关重要。HmuY作为一种新型血红素载体蛋白第一次被Olczak在P.gingivalis中发现，并经研究证实，其主要暴露在P.gingivalis细菌表面，且可以外膜囊泡和可溶性脂蛋白的形式释放到宿主环境中，因此在慢性牙周炎中，Hmuy不仅为宿主提供免疫识别，同时还能构成一个系统刺激因素，从而在慢性牙周炎的发生和发展中有着重要意义。本文就慢性牙周炎的发病机制以及HmuY蛋白在慢性牙周炎发病中的作用机制作一综述。

1.慢性牙周炎的免疫发病机制

牙周炎是一种常见的感染性疾病，细菌感染是其主要的致病因子，而机体免疫系统对感染源的免疫应答则在疾病的发生和进展中发挥着关键作用。CD4 和CD8 T细胞被微生物成分识别并激活后，可分化成许多功能不同的亚群，而每个亚群又可表达不同的细胞因子和转录因子。其中核转录因子kappaB（NuclearfactorkappaB，NF-κB）是一个关键的转录因子复合物，能通过与多种细胞的增强子和启动子序列位点发生特异性结合，而参与炎症反应，并对炎症反应级联放大，同时在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化；但NFκB的激活可能会被B细胞κ轻链基因增强子核因子抑制蛋白1（NF-kappa-Binhibitor-likeprotein1，NFKBIL1）的表达所抑制，而NFKBIL1的遗传变异则与炎症和（或）自身免疫性疾病的易感性相关。

国内外研究发现，白细胞介素-1（interleukin，IL-1）在牙周炎发病过程的宿主免疫反应中起到关键作用。IL-33是IL-1家族中新发现的一个成员，IL-33的分泌可以促进炎性反应因子如IL-4、IL-5的表达增加，而IL-33前体在细胞核中的堆积则能够抑制炎性反应因子基因的表达。在炎症性疾病中，IL-33会引起一些反应）:如肥大细胞脱颗粒和炎性细胞的产生（包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等）。炎症介质的释放和IL-33诱导成骨细胞活化，可促进NF-κB受体活化因子配基（RANKL）的表达，并抑制骨保护蛋白（OPG）的表达以及随后的破骨细胞活化。

2.HmuY型hemophore的致病机制

2.1新型HmuY型Hemophore的发现

血红素载体Hemophore是G-菌分泌到胞外（或锚定于外膜）的一种能够与血红素蛋白（Hemoprotein）中的血红素结合，或使血红素从血红素蛋白中游离出来，并高效率地将血红素呈递给细胞外膜受体的蛋白，在不同G-菌中已发现3种类型的血红素载体，分别是HasA、HusA和HmuY。外膜血红素受体经Hemophore介导所结合血红素的效率远远超过其直接与血红素或血红素蛋白结合的效率，因此Hemophore介导的血红素转运系统是细菌更重要的血红素转运系统。Olczak等报道，在P.gingivalis中发现的编码外膜血红素受体R（HmuR）的hmuR基因的操纵子上有一个hmuY基因；由于该基因所表达的蛋白HmuY可以与血红素结合并能以锚定在细胞膜或分泌出细胞的2种形式存在，而且HmuY的表达受铁离子浓度调控（在低铁环境下表达量更高），最终被鉴定为是一种不同于HasA和HuxA的新型的Hemophore蛋白。Wojtowicz等探索了HmuY的结构特点，并验证了其稳定的结构是血红素载体的基础。

2.2HmuY摄取血红素的机制

血红素是P.gingivalis在宿主环境中必要的营养物质之一。但由于P.gingivalis的HmuY结合血红素的能力低于宿主的血红素结合蛋白，血红素不能主动地从宿主的血红素结合蛋白中转移到HmuY上。因此，细菌为了得到血红素首先需要分泌牙龈蛋白酶R（Rgp）、牙龈蛋白酶K（Kgp），并通过与HmuY结合而共同完成血红素的摄取。有研究表明，Kgp和精氨酸特异蛋白酶（HrgpA）能通过结合血红蛋白而氧化成高铁血红蛋白并使其裂解，HmuY蛋白可以从被氧化成的高铁血红蛋白中获取血红素。HmuY结合血红素后可通过形成二聚体或四聚体而将血红素包埋于其中心，随后再由HmuY将血红素呈递给与其同源的外膜受体HmuR。

由于外膜受体HmuR与血红素的亲和力远低于HmuY与血红素的亲和力，并且HmuY与血红素结合牢固，因此HumY四聚体外膜与HmuR接触后必须通过裂解才能释放血红素；然后再由外膜受体HmuR捕获血红素，并使其通过外膜而进入细胞质。但此机制目前尚处于推测阶段，还有待进一步研究证实。

3.HmuY在慢性牙周炎中引起相关免疫反应的作用

3.1HmuY在与其他牙周致病菌合作中的作用

近年来新发现的细菌属———互养菌属，在口腔疾病中有较高检出率，如P.gingivalis、福赛坦氏菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体等均属于该菌属。这些细菌在口腔生物膜上可通过细菌之间的相互竞争（合作）而获取营养物质，并进行互养。血红素（铁原卟啉IX）是P.gingivalis和中间普氏菌维持生长和毒力的必须营养元素，而这两种细菌则分别靠精氨酸特异蛋白酶（arginine-specificgingipainproteasesRpgA）和半胱氨酸蛋白酶（InterpainA）对血红素进行摄取。由于HmuY的一个重要功能是可以保持丰富的功能性蛋白酶环境，因此可通过建立以上两种蛋白的相互合作关系，以增进两种微生物之间血红素的摄取。最近研究显示，包括P.gingivalis在内的黑色素厌氧菌展现了一种新型血红素摄取模式，即血红蛋白将首先被氧化成高铁血红蛋白，以利于血红素的释放。

P.gingivalis菌株W83、W50的精氨酸特异蛋白酶和中间普氏菌的半胱氨酸蛋白酶均能够充分水解高铁血红蛋白并使之释放出游离的血红素。重要的是，由于HmuY具有抗蛋白酶水解的作用，因此能够与P.gingivalis的牙龈蛋白酶或中间普氏菌的半胱氨酸蛋白酶合作，从被氧化成的高铁血红蛋白中摄取血红素。

3.2HmuY在感染巨噬细胞中的免疫调节作用

牙周炎患者的牙周组织往往被密集的炎性细胞浸润，其中包括单核巨噬细胞，在微生物及其产物的作用下，单核巨噬细胞可通过其分泌的介素而在宿主的炎症反应中起重要的调节作用。巨噬细胞根据诱导途径和表型不同分为经典途径活化的M1型和选择性活化的M2型。一些研究为了分析HmuY在P.gingivalis入侵巨噬细胞过程中的作用，建立了巨噬细胞感染模型进行研究。即首先采用PMA将THP-1细胞诱导成巨噬细胞，然后再将其分化成M1极化表型，实验结果显示:在模仿复制体内的情况下，HmuY对P.gingivalis的生长有着重要作用，与野生型菌株相比，HmuY变异株在加入HmuY纯化蛋白后其生长效率增加，而HmuY基因的失活则会引起P.gingivails活细胞粘附于THP-1巨噬细胞上的量显著减少，有效入侵巨噬细胞的HmuY变异株也明显减少；部分补充纯化HmuY蛋白的HmuY变异株入侵和附着宿主细胞的趋势增加。

另有研究证实，巨噬细胞被P.gingivalis的HmuY蛋白感染后，可以引起其高表达IL-1β，这种细胞因子可抑制巨噬细胞的凋亡，从而阻碍P.gingivalis在宿主中被清除。Olczak等报道，用P.gingivalis产生的HmuY蛋白刺激巨噬细胞可使其产生IL-6的量增加，这可能会导致P.gingivalis特异性抗体在慢性牙周炎患者的血清中升高。Gmiterek等在相关研究中也发现，P.gingivalis产生的HmuY蛋白还可以增加TNF-α的表达水平，纯化的HmuY蛋白则可通过诱导表达基因趋化因子CCL3L1和CCl4，而参与活化T细胞和HmuY蛋白本身；作者认为，HmuY无论是在外膜结合的形式还是在可溶性蛋白的形式，均可能负有巨噬细胞免疫的调节作用。虽然用HmuY单独刺激巨噬细胞的模型相较于P.gingivalis野生株刺激巨噬细胞模型较局限，但仍然可以认为HmuY蛋白在巨噬细胞免疫中起着重要的作用。

3.3HmuY在宿主免疫反应中的作用

P.gingivalis不仅会定植于宿主细胞的不同细胞器（包括细胞质、内噬体及自噬体）中，由P.gingivalis产生的外膜囊泡亦可通过依赖脂质筏内吞途径进入宿主细胞，并途径内噬体运送到溶酶体隔间中；当P.gingivalis细胞裂解或分泌外膜囊泡后，其所释放的抗原可以被识别并被抗原提呈细胞（如巨噬细胞）处理，从而引起适应性免疫反应和激活而产生抗体。最近研究证实，HmuY蛋白具有免疫原性，其在慢性牙周炎中可被宿主的免疫系统识别。而抗HmuY抗体则可抑制P.gingivalis的生长和生物膜的形成。针对P.gingivalis菌株A7436、ATCC33277HmuY产生的抗体，对高度纯化的HmuY以及与细胞结合的HmuY均有高度特异性，并且与中间普氏菌和福赛坦氏菌中发现的HmuY同系物不发生交叉反应。

这表明，在慢性牙周炎患者血清中，P.gingivalisHmuY可作为特异性抗原刺激机体产生更多的P.gingivalis特异性抗体。有一些研究已表明，在P.gingivalis的W83、W50和ATCC33277菌株中发现的成纤维细胞活化因子（fibroblast-activatingfactor，FAF），对正常人牙龈成纤维细胞以及脐静脉内皮细胞均具有促增殖作用。与用P.gingivalisLPS刺激的细胞相比，FAF同样能诱导人牙龈成纤维细胞产生高水平的IL-6。值得一提的是，FAF的氨基酸序列与P.gingivalisHmuY蛋白区域的氨基酸序列相同。由此可推测，HmuY蛋白可能具有与FAF相似的生物学功能。综上所述，HmuY是一重要的致病因子，在慢性牙周病的发生发展中起着不可忽视的作用。

4.小结

牙周病是由细菌引起的感染性疾病，可引起明显的宿主免疫反应。P.gingivalis已被认为是慢性牙周炎的主要病原体，而HmuY则可使P.gingivalis生长在血红素缺乏的宿主环境中。目前，关于HmuY蛋白在慢性牙周炎诊断、治疗中的作用和意义已基本明确，其在慢性牙周炎发病机制中所起的作用也受到了越来越多的关注。因此，HmuY蛋白有可能是治疗牙周病的一种新的作用靶点。

来源：牙体牙髓牙周病学杂志2017年第27卷第3期

来源：医脉通